Lodisz str. 184 się zaczyna.
Techniki oparte na mikroskopie świetlnym
technika mikroskopii jasnego pola - tkanki i komórki są właściwie przeźroczyste, więc trzeba je utrwalać, ciąć na kawałki i barwić.
kontrast fazowy - opiera się na różnicy we współczynniku załamania światła komórek i medium, pozwala obrazować żywe komórki. Krawędzie faz otoczone są prążkami pochodzącymi z interferencji światła o różnej dyfrakcji. Pokazuje na raz całą grubość preparatu, więc nadaje się tylko do cienkich komórek/warstw. Użyteczny zwłaszcza do obserwacji ruchów dużych organelli w komórce
DIC - kontrast światła spolaryzowanego (kontrast Nomarskiego) - to samo co poprzednia technika, ale opiera się na interferencji światła spolaryzowanego. Pokazuje skrawki optyczne, więc nadaje się do obserwacji grubszych preparatów
technika ciemnego pola - między źródłem światła a obiektem znajduje się nieprzepuszczalna płytka, a po bokach lustra. Do okularu trafia tylko światło ugięte prze gęste optycznie elementy komórek. Pojawiają się jako jasne punkciki na czarnym tle.
mikroskopia fluorescencyjna - wykorzystuje zjawisko fluorescencji - emisji światła o określonej długości fali po wzbudzeniu inną (krótszą) falą. Wzbudzać można za pomocą normalnego światła rozproszonego (epifluorescencyjna) albo laserem (konfokalna)
najlepsza rozdzielczość mikroskopii świetlnej jest ograniczona długością świtała widzialnego i wynosi około 200nm
Mikroskop fluorescencyjny i jego odmiany
mikroskop epifluorescencyjny - lampa rtęciowa lub halogenowa daje świtało, które monochromatyzuje się na filtrze. Światło to odbija się od lustra dichroicznego i pada z góry na preparat, przechodząc przez obiektyw. Światło emitowane przez preparat jest zbierane przez soczewki obiektywu, przechodzi przez lustro dichroiczne i trafia do okularu. Widać fluorescencję całej grubości preparatu, więc może być zamazany obraz.
mikroskop diafluorescencyjny - zasada podobna jak w epifluorescencyjnym, ale obserwacja w świetle przechodzącym, co oznacza chyba, że światło wzbudzenia wpada też do okularu (jak w zwykłym świetlnym).
Mikroskop konfokalny - z użyciem laser, patrz punkt następny
Raczej mało rzeczy wykazuje naturalną fluorescencję, poza tym często jest niespecyficzna. Dlatego też często używa się różnych barwników fluorescencyjnych
kw. nukleinowe + barwniki:
oranż akrydyny + DNA - żółty
oranż akrydyny + RNA - ostro pomarańczowy
jodek propidyny + RNA/DNA - czerwony
DAPI + DNA - niebieski
jodek propidyny + DAPI + RNA/DNA - DAPI przyćmiewa fluor. jodku propidyny - dobrze widoczne DNA i RNA
przeciwciała skoniugowane z barwnikami fluorescencyjnymi lub białkiem A w kompleksie ze złotem koloidalnym
?obserwacja niebezpośrednia - sprzęganie enzymu z przeciwciałami, które rozkładają specjalne substraty dając fluoryzujące produkty np. peroksydaza chrzanowa - 4-chloro-1-naftol lub diaminobenzydyna, alkaliczna fosfataza - 5-bromo-4-chloro-3-indolil. NIE JESTEM PEWNIEN TEGO PUNKTU. Wydaje mi się, że to jest technika nie używana w mikroskopii fluorescencyjnej, tylko zwykłej i nie jestem pewien czy te produkty naprawdę świecą :P ?
ekspresja konstruktów białek z GFP
Mikroskop konfokalny
Różni się tym, że próbka jest oświetlana laserem po kolei w serii malutkich kropek, a światło emitowane przechodzi przez szczelinę, która nie przepuszcza większości światła z rzeczy poza płaszczyzną ostrości. Tworzy to jakby bitmapę cienkiego skrawka optycznego, co pozwala uzyskać ostre obrazy nie tnąc komórek. Składając komputerowo serię obrazów z różnych głębokości preparatu można stworzyć obraz 3D.
Mikroskop elektronowy
Generalnie polega na tym samym co świetlny, ale falą niosącą informacje jest fala elektronowa, która ma dużo mniejszą długość, a co za tym idzie - lepszą rozdzielczość (teoretycznie nawet 0,005nm, w praktyce ok 0,1nm). Zamiast lampy jest rozgrzany drut, czyli katoda. Soczewki są cewkami magnetycznymi kondensującymi i zakrzywiającymi tor elektronów a nie szklane. Niestety wiązka elektronów ma małą penetracją, co oznacza że skrawki muszą być ultra-cienkie (50-100nm), a poza tym jest absorbowana przez powietrze, czyli całość drogi „optycznej” mikroskopu no i próbka muszą być w próżni.
Mikroskopia elektronowa ma ten sam problem co świetlna, tzn. ultra-cienkie skrawki komórek są przeźroczyste dla elektronów. Dlatego też stosuje się związki metali ciężkich, które łączą się np. z błonami lipidowymi i rozpraszają elektrony. Można też użyć przeciwciał połączonych z białkiem A ze złotem koloidalnym, żeby wyznaczać pojedyncze białka (pojawią się jako ciemne kuleczki). Generalnie technika nie nadaje się do obserwacji żywych komórek, bo trzeba je pociąć i odwodnić w próżni, ale jest technika, która choć też zabija komórki to nie odwadnia ich, czyli nie denaturuje makromolekuł. Polega na zamrażaniu w -196 stopniach i wtedy woda nie wyparowuje nawet w dobrej próżni.
To wszystko dotyczy mikroskopu transmisyjnego elektronowego (TEM), o skaningowym (SEM) w punkcie 6.
Techniki przygotowywania preparatów do mikroskopii elektronowej
normalna tzn. barwienie czymś z metalem ciężkim (sole osmu, wolframiany), zatopienie w żywicy, cięcie i heja
kriomikroskopia - próbki nanosi się w postaci cieniutkiego filmu wodnego i szybko zamraża do -196stC ( z dodaniem mounta który zapobiega tworzeniu się kryształów wody i rozwalaniu struktur). Ponieważ jest tak zimno, woda nie paruje i nic się nie denaturuje
metal shading - (tworzenie replik) próbkę kładzie się na mikowej bazie i suszy, potem naparowuje platynę albo ind pod kątem. Sprawia to, że tam gdzie powierzchnie tworzyły bardziej prosty kąt z kierunkiem naparowywania jest grubsza warstwa metalu i jest ciemniej na obrazku. metal pokrywa się naparowanym węglem dla stabilizacji, a oryginalną próbkę wytrawia kwasem. Tak uzyskany obraz daje złudzenie trójwymiarowości. Używa się tego do obserwacji kształtu oczyszczonych wirusów, kompleksów i dużych białek
freeze-fracture - próbkę się mrozi (do bardzo niskich temp. ciekły He koło 4K), a potem ścina nożem, co powoduje, że błony lipidowe pękają w zrębach hydrofobowych, między listkami. Potem robi się metal shading i można obserwować kształty powierzchni błon lipidowych
freeze-etching - coś jak freeze-fracture, tylko po pęknięciu sublimuje się wodę. W próżni woda odparowuje z różną prędkością w zależności czy jest związana w jakichś kompleksach czy wolna w cytozolu. Tam gdzie szybciej odparuje będą dołki. Potem robi się metal shading.
całkowite rozproszenie chromatyny - rozrywa się jądra, ich zawartość się wylewa i rozprowadza do super cienkich warstw. Barwi się metalami ciężkimi i widać ładnie rozłożoną chromatynę
Mikroskop skanujący elektronowy SEM i transmisyjny TEM
TEM to ten co opisany był wyżej. Wiązka elektronów z katody jest kondensowana na soczewkach kondensatora, przechodzi przez próbkę, soczewki obiektywu, okularu i trafia na ekran/kliszę/rejestrator elektroniczny. W SEM bardzo intensywna wiązka elektronów po skondensowaniu jest kierowana przez zestaw soczewek po kolei na poszczególne „piksele” próbki pokrytej metalem (przez metal shading). Wzbudzony metal emituje własne elektrony, tzw. elektrony wtórne, które są wykrywane na detektorze. Ilości emitowanych elektronów wtórnych jest zależna od kąta pod którym pada wiązka wzbudzająca (im bliższy 90st. tym więcej) dlatego obraz daje złudzenie 3D. Technika ta pozwala oglądać powierzchnię niepociętych próbek, ale ma rozdzielczość jedynie ok 10nm.