Barwienie w cytodiagnostyce
Papanicolau- powszechnie przyjęta metoda barwienia preparatów do cytodiagnostyki
HE- barwienie ogranicza wartości diagnostyczne preparatów cytologicznych, dlatego powinno być zaniechane
Barwienia specjalne oraz immunocytochemia- stosunkowo rzadko wykorzystywane w cytologii ginekologicznej
barwienie papanicolau(pap)-
7 modyfikacji- wybiera się tą która pasuje osobie oceniającej preparat
intensywność wyzna kowania jądra i cytoplazmy mogą być różne
podstawowe barwienie w cytologii
3 barwniki:
a. hematoksylina harrisa
b. oranż G, OG-6
c .EA(kilka barwników)
Efekty wybarwienia:
jądro komórkowe- niebieskie, stukturze ......, dobrze zachowane szczegóły budowy(„zgniecione”)
cytoplazma- szerokie spektrum kolorów co umożliwia odróżnienie komórek aktywnych metabolicznie(kolor niebiesko- zielony) od nieaktywnych(kolor różowy
Hematoksylina(zasadowa)
barwi związki o charakterze kwasowym
proszek- (zredukowana forma)
+jodek sodu/tlenek rtęci(utlenianie)
hemateina
+ ałun potasu/amonowy- wywołuje powstanie typowego ciemnoniebieskiego lub purpurowego zabarwienia hematoksyliny
w pH zasadowym hemateina barwi strukturę komórki na kolor niebieski
w pH kwaśnym na purpurowo
Podział barwień:
barwienie progresywne- barwimy komórki do zabarwienia, które jest pożądane, hematoksylina z kwasem octowym
barwienie regresywne-przebarwiamy komórkę, a następnie usuwamy odbarwiaczem, w barwieniu Papanicolau nadmiar hematoksyliny jest usuwany kwasem solnym, hemtoksylina bez kwasu octowego
kwaśne środowisko uzyskane przez dodatek kwasu octowego(kw.cytrynowego)do hematoksyliny wzmacnia znakowanie jądra poprzez stabilizację kompleksu ałun- hemateina
Rodzaje hematoksyliny:
hematoksylina Harrisa
utlenienie hematoksyliny do hemateiny zachodzi dzieki działaniu tlenku rtęci
najczęściej używana do barwienia regresywnego(niektórzy stosuja także do barwienia progresywnego)
ałun potasowy lub amonowy
kwas octowy- tylko do barwienia progresywnego
nadmiar barwnika w barwienie regresywnym jest usuwany za pomoca kwasu solnego(0,25%), nastepnie kwas jest wypłukiwany za pomocą wody bieżącej
Hematoksylina Meyera
utlenianie hematoksyliny do hemateiny zachodzi dzieki dzialaniu jodku sodu
głównie do barwienia preparatów histologicznych(bar. Progresywne)
substancje odpowiedzialne za indukcje koloru w barwieniu jest ałun amonowy
hematoksylina Gilla
tylko i wyłacznie do barwienia w automatach(do barwienia progresywnego, ponieważz w automatach się nie odbarwia)
Jądro komórkowe po barwieniu regresywnym:
jednolite i ciemniejsze
intensywniej zaznaczone rejony jądrowej hiperchromatazji
chromatyna doskonale uwidoczniona
wyraźny kontrast pomiędzy jądrem a cytoplazmą
Bluing agents(odbariacze)
wpływ na zabarwienie jądra komórkowego
pozwala na usunięcie tła spowodowanego przez działanie hematoksyliny
sprawiają , że szczegóły budowy j. kom są znacznie lepiej widoczne
wzmacnia się przezroczystość cytoplazmy
Najczęściej używane bluing agents:
węglan litu
woda amoniakalna
woda bieżąca o pH wyższym niż 8
Barwienie cytoplazmy:
oranż G
barwnik kwaśny , barwienie keratyną na kolor pomarańczowy
keratyna nie jest obecna w zdrowych komórkach plaskobłonkowym może być obecna w keratynizowanych komórkach raka
określenie występowania „pomarańczowym” komórek jest zatem ważne w diagnostyce
w wielu laboratoriach dodaje się kwas octowy do barwnika aby wzmocnić specyficzność barwnika i skrócić czas barwienia
dodatek kw. Fosfowolframowego, który silnie wiąże się do białek pozwala na lepsze zachowanie koloru
Barwnik EA
eozyna Y
zieleń świetlna SF
kwas fosfowolframowy(do wzmacniania koloru)
hematoksylina rozpuszczalna w wodzie
reszta barwników przygotowywana na bazie etanolu i nim także wypłukiwane.
ANALIZA ZABURZEŃ GENETYCZNYCH NA POZIOMIE BIAŁEK
Izolacja białka totalnego , elektroforeza, przecięcie białek na membranę , charakterystyka interesujących nas białek z użyciem przeciwciał(western blotting)
Wyjmujemy żel ze szklanych szybek
Struktura kanapka
bibuła
żel po elektroforezie
membrana celulozowa
na dole kilka warstw bibuły nasączone buforem
Białka wędrują w żelu i przenoszą się na membranę, żel pozbawiony białek usuwamy, zajmujemy się membraną.
Blokowanie membrany(tła- BSA albumina serum wołowego)
Przeciwciała I
Przeciwciało II(znakowane enzymem- alkaliczna fosfataza)
Substrat
Przygotowanie żelu-> polimeryzacja w żel-> nakładanie białka zabarwionego na niebiesko(żebyśmy wiedzieli kiedy skończy się elektroforeza)-> umieszczamy płytki w komorze elektroforetycznej{jednocześnie można zrobić 4 żele, przy czym jeden przeznaczany jest do barwienia}.
1.Barwienie wg Papanicolau:
woda włożyć preparaty
hematoksylina wg Harrisa 4 min
woda bieżąca płukać 3x
odbarwiacz
woda amoniakalna
woda bieżąca płukać długo
alkohol 96%- 2 min
OG-6 5min
alkohol 96% 1 min
EA-50 5 min
alkohol 96% 1 min
alkohol 96% 1 min
aceton płukać 3x
ksylen prześwietlić
zamknąć balsamem
2.Bufor do elektroforezy TBE
T- tris HCl nadaje pH buforowi, siła jonowa
B- kw. Borowy, umożliwia wędrówkę jonów w polu elektrycznym
E- EDTA wiąże jony dwuwartościowe głównie jony Mg2+ niezbędne dla działania nukleaz
Ostatecznie stężenie w żelu 1 raz
3.Bufor probówkowy:
dwa barwniki
cyjanoksylen- barwnik, który wędruje tak samo szybko jak białka
blekit bromofenolowy- barwnik, który wędruje szybciej niż białka, sygnał do ukończenia elektroforezy, gdy 1 cm od końca żelu
4. Składniki żelu poliakryloamidowego:
bisakrylamid
akrylamid
w różnych proporcjach 19:1; 49:1; 29:1; 37,5:2(dla białek)
od proporcji zależy porowatość żelu
gliceryna- umożliwia nałożenie żelu do kieszeni
5. Katalizatory:
nadsiarczan amonu(APS)- zawsze na świeżo
TEMED
Literatura:
Słomski „Analizy DNA”
Genomy