CYTOLOGIA ćw.4 15.04.20011r.
Skład żelu do elektroforezy:
Żel agarozowy 2% (1g)
Bromek etydyny- używany do elektroforezy DNA
1xTBE (100ml)
Grzebień- słuzy do wyzanczenia miejsca nakładania prób- wkłada się w dowolne miejsce, ale najlepiej z boku- by było miejsce do rozejścia się prążka
Następnie żel polimeryzuje
Przygotowanie prób do nałożenia na żel : 4µl PCR produkt + 6µl H2O + 2µl Loading Dye = 12µl
Przygotowanie żelu : 1g agarozy + 100ml 1xTBE buffer + 5µl bromku etydyny
Próby DNA- są to próby po reakcji PCR
Wykrywanie obecności mutacji w wybranym genie:
Izolacja DNA z tkanek zatopionych w parafinie
Jakościowa i ilościowa analiza uzyskanego DNA
Projektowanie starterów do określonej sekwencji DNA
Amplifikacja wybranego fragmentu DNA z użyciem starterów (PCR)
Elektroforeza agarozowa produktów PCR- pojedyncze paski
Oczyszczanie produktu PCR z żelu agarozowego
Enzymatyczne trawienie oczyszczonego produktu PCR
W jaki sposób wykryć mutacje?
Wybieramy gen (np. pochodzący z jelita) i wiemy, ze w danej jednostce chorobowej jest mutacja danego genu- np. genu BRAF- będzie to mutacja przy C-końcu (dokładnie mutacja V600E)
Poziom ekspresji genu- postępowanie:
Ad. 1)
Materiał z bloczka parafinowego- ścinamy ok. 10 fragmentów o grubości 5 µm
Materiał może pochodzić również z hodowli komórkowej- będzie to wtedy materiał świeży cytologiczny
Izolacja DNA z tkanki- skrawki wkładamy do eppendorfów i łączymy je z buforem lizującym → następuje izolacja kwasu nukleinowego
Ad. 2)
Analiza ilosciowa- wykrywa ilość DNA- metodą spektrofotometryczną
Analiza jakosciowa- przeprowadzamy ją na żelu agarozowym
A- dobra jakość
Marker wielkości DNA 1 2 3
2-3- próby DNA dobrej jakości
B- zła jakość
1. Marker wielkości 1 2 3
2. 2,3- próby zdegradowanego DNA(smugi)
* nukleazy tną DNA w różnych miejscach-powstają małe cząsteczki i większe cząsteczki DNA → tworzy się smuga
Ad. 3)
Ten etap jest potrzebny do wykonania później reakcji PCR
Do projektowania starterów wykorzystuje się program internetowy: Primer3: WWW primer tool dostępny na stronie: http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi
Projektowanie starterów do reakcji PCR→ PUB-MED- tam znajdują się wszystkie geny i sekwencje (wybiera się odpowiednią ilość nukleotydów, temperaturę itd.)
Do wykonania reakcji PCR potrzebujemy:
DNA matrycowego
Polimerazy DNA
Nukleotydów
Buforu
Startery musza się zaczynać w takim miejscu, aby okalać okolicę, w której występuje mutacja ( okalają to miejsce zarówno z prawej, jak i z lewej strony)
Mutacja w jelicie V600E- zamieniony zostaje 600 aminokwas.
Zamieniona zostaje: A→T 3'CAC→CTC5'
T→A 5'GTG→GAG3'
Ad. 4) Przebieg reakcji PCR
Reakcja PCR- zasada metody- 1. Cykl
Ogrzewanie hybrydyzacja
w celu starterów synteza DNA
rozdzielenia począwszy od startera
łańcucha
Dwuniciowy DNA
ETAP: 1 2 3
ETAP:
Ogrzewamy do 95oC- w celu rozerwania wiązań wodorowych pomiędzy dwuniciową cząsteczką DNA.
Obniżamy temperaturę do ok. 50oC- wtedy możliwe jest przyłączenie starterów (kolor: żółty i zielony) Jeden starter do jednej nici, drugi do drugiej.
Podgrzewamy próby do ok. 72oC- jest to temperatura optymalna do działania polimerazy.
Następnie w drugim cyklu powtarzane są etapy 1,2 i 3, potem następuje kolejny cykl- itd. [przechodzimy przez ok 30-40 cykli]
Ostateczny efekt- otrzymujemy cząsteczki wybranego genu BRAF DNA
W pierwszym cyklu mamy 2 dwuniciowe cząsteczki DNA, w drugim mamy już 4 takie cząsteczki, w 3 będzie ich 8 itd.
Ad. 5)
Elektroforeza przeprowadzana jest na żelu agarozowym.
Produkty wycinamy z żelu skalpelem
Ad. 6)
Po otrzymaniu 6 prób- z każdej wycinamy skalpelem fragment tego żelu, który nam powstał. Następnie traktujemy to specjalnymi substancjami, które oczyszczą DNA. (KIT - rozpuszcza agarozę).
Trawimy fragment np. metodą RFLP albo odczytujemy nukleotydy sekwenatorem.
[Sekwenator - urządzenie, które odczytuje poszczególne fragmenty DNA]
RFLP:
metoda, która polega na cięciu restrykcyjnym z użyciem enzymów restrykcyjnych izolowanych z bakterii
cięcie kwasów nukleinowych w odpowiednim miejscu
cięta jest ciągle ta sama sekwencja
W wyniku trawienia - po elektroforezie, otrzymamy 2 prążki jeżeli w DNA nie będzie mutacji lub 3 prążki jeżeli będzie obecna mutacja.
W metodzie RFLP używa się specjalnych markerów, np. markerów wielkości - pokazują nam one jaką wielkość ma dany produkt. Izoluje się DNA faga λ i wybieramy enzymy restrykcyjne, które potną to DNA i uzyskamy prążki o znanej wielkości.
Mikrodysekcja- wycina się pojedyncze komórki
Komputer + laser - można zaznaczyć tylko te komórki, które nas interesują- laser wycina te komórki i przenosi je do ependorfa ( po hybrydyzacji In situ też można)- szkiełko zabarwia się przy użyciu H&E.
Potrzebne jest do tego kilka PCR- sekwencjonowanie- wykrywanie mutacji w wybranym genie- sekwencjonowanie
Określenie ilości transkryptu- zajmujemy się RNA!:
Określenie poziomu ekspresji genów w różnych tkankach- izolacja RNA, odwrotna transkrypcja do cDNA. Amplifikacja fragmentów badanego cDNA metodą PCR w celu zbadania poziomu ekspresji genów/ relatywnej ilości analizowanego tran skryptu- wyniki półilościowego RT-PCR
Reakcje PCR prowadzi się tylko na DNA! (polimerazy DNA nie będą działały na RNA)
Jeśli mamy do czynienia z RNA to musimy za pomocą odwrotnej transkryptazy zamienić go w cDNA :
RNA odwrotna transkryptaza DNA ( nazywane cDNA) * cDNA= mRNA bez uracylu
W badaniu poziomu ekspresji genu musimy dodać 4 startery : 2 normalne i 2 do aktyny (house-keeping gene = gen metabolizmu podstawowego, nie zawsze jest to aktyna)
InACT-4: wynik badania poziomu ekspresji aktyny
In2TL- badanie poziomu ekspresji genu badanego
Półilościowy- bo dokładnie nie można określić ilości genu, wynik podaje się w odniesieniu do aktyny
RT-PCR (real time PCR)- ilościowy PCR
+ polimeraza DNA
+ dATP, dGTP, dCTP, dTTP