CYTOLOGIA ćw4, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, Cytologia


CYTOLOGIA ćw.4 15.04.20011r.

Skład żelu do elektroforezy:

Grzebień- słuzy do wyzanczenia miejsca nakładania prób- wkłada się w dowolne miejsce, ale najlepiej z boku- by było miejsce do rozejścia się prążka

Następnie żel polimeryzuje

Przygotowanie prób do nałożenia na żel : 4µl PCR produkt + 6µl H2O + 2µl Loading Dye = 12µl

Przygotowanie żelu : 1g agarozy + 100ml 1xTBE buffer + 5µl bromku etydyny

Próby DNA- są to próby po reakcji PCR

Wykrywanie obecności mutacji w wybranym genie:

  1. Izolacja DNA z tkanek zatopionych w parafinie

  2. Jakościowa i ilościowa analiza uzyskanego DNA

  3. Projektowanie starterów do określonej sekwencji DNA

  4. Amplifikacja wybranego fragmentu DNA z użyciem starterów (PCR)

  5. Elektroforeza agarozowa produktów PCR- pojedyncze paski

  6. Oczyszczanie produktu PCR z żelu agarozowego

  7. Enzymatyczne trawienie oczyszczonego produktu PCR

W jaki sposób wykryć mutacje?

Wybieramy gen (np. pochodzący z jelita) i wiemy, ze w danej jednostce chorobowej jest mutacja danego genu- np. genu BRAF- będzie to mutacja przy C-końcu (dokładnie mutacja V600E)

Poziom ekspresji genu- postępowanie:

Ad. 1)

  1. Materiał z bloczka parafinowego- ścinamy ok. 10 fragmentów o grubości 5 µm
    Materiał może pochodzić również z hodowli komórkowej- będzie to wtedy materiał świeży cytologiczny

  2. Izolacja DNA z tkanki- skrawki wkładamy do eppendorfów i łączymy je z buforem lizującym → następuje izolacja kwasu nukleinowego

Ad. 2)

  1. Analiza ilosciowa- wykrywa ilość DNA- metodą spektrofotometryczną

  2. Analiza jakosciowa- przeprowadzamy ją na żelu agarozowym

A- dobra jakość

  1. 0x08 graphic
    0x08 graphic
    0x08 graphic
    Marker wielkości DNA 1 2 3

  2. 0x08 graphic
    0x08 graphic
    0x08 graphic
    0x08 graphic
    0x08 graphic
    0x08 graphic
    0x08 graphic
    0x08 graphic
    0x08 graphic
    0x08 graphic
    0x08 graphic
    2-3- próby DNA dobrej jakości

0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
B- zła jakość
1. Marker wielkości 1 2 3
2. 2,3- próby zdegradowanego DNA(smugi)

* nukleazy tną DNA w różnych miejscach-powstają małe cząsteczki i większe cząsteczki DNA → tworzy się smuga

Ad. 3)

  1. Ten etap jest potrzebny do wykonania później reakcji PCR

  2. Do projektowania starterów wykorzystuje się program internetowy: Primer3: WWW primer tool dostępny na stronie: http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi

  3. Projektowanie starterów do reakcji PCR→ PUB-MED- tam znajdują się wszystkie geny i sekwencje (wybiera się odpowiednią ilość nukleotydów, temperaturę itd.)

  4. Do wykonania reakcji PCR potrzebujemy:

  1. Startery musza się zaczynać w takim miejscu, aby okalać okolicę, w której występuje mutacja ( okalają to miejsce zarówno z prawej, jak i z lewej strony)

  2. Mutacja w jelicie V600E- zamieniony zostaje 600 aminokwas.
    Zamieniona zostaje: A→T 3'CAC→CTC5'
    T→A 5'GTG→GAG3'

Ad. 4) Przebieg reakcji PCR

0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
Reakcja PCR- zasada metody- 1. Cykl

0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
Ogrzewanie hybrydyzacja
w celu starterów synteza DNA
rozdzielenia począwszy od startera
łańcucha

0x08 graphic
0x08 graphic
0x08 graphic
Dwuniciowy DNA

ETAP: 1 2 3

ETAP:

  1. Ogrzewamy do 95oC- w celu rozerwania wiązań wodorowych pomiędzy dwuniciową cząsteczką DNA.

  2. Obniżamy temperaturę do ok. 50oC- wtedy możliwe jest przyłączenie starterów (kolor: żółty i zielony) Jeden starter do jednej nici, drugi do drugiej.

  3. Podgrzewamy próby do ok. 72oC- jest to temperatura optymalna do działania polimerazy.

  4. Następnie w drugim cyklu powtarzane są etapy 1,2 i 3, potem następuje kolejny cykl- itd. [przechodzimy przez ok 30-40 cykli]

  5. Ostateczny efekt- otrzymujemy cząsteczki wybranego genu BRAF DNA

  6. W pierwszym cyklu mamy 2 dwuniciowe cząsteczki DNA, w drugim mamy już 4 takie cząsteczki, w 3 będzie ich 8 itd.

Ad. 5)

Elektroforeza przeprowadzana jest na żelu agarozowym.
Produkty wycinamy z żelu skalpelem

Ad. 6)

Po otrzymaniu 6 prób- z każdej wycinamy skalpelem fragment tego żelu, który nam powstał. Następnie traktujemy to specjalnymi substancjami, które oczyszczą DNA. (KIT - rozpuszcza agarozę).

Trawimy fragment np. metodą RFLP albo odczytujemy nukleotydy sekwenatorem.

[Sekwenator - urządzenie, które odczytuje poszczególne fragmenty DNA]

RFLP:

W wyniku trawienia - po elektroforezie, otrzymamy 2 prążki jeżeli w DNA nie będzie mutacji lub 3 prążki jeżeli będzie obecna mutacja.

W metodzie RFLP używa się specjalnych markerów, np. markerów wielkości - pokazują nam one jaką wielkość ma dany produkt. Izoluje się DNA faga λ i wybieramy enzymy restrykcyjne, które potną to DNA i uzyskamy prążki o znanej wielkości.

Mikrodysekcja- wycina się pojedyncze komórki
Komputer + laser - można zaznaczyć tylko te komórki, które nas interesują- laser wycina te komórki i przenosi je do ependorfa ( po hybrydyzacji In situ też można)- szkiełko zabarwia się przy użyciu H&E.
Potrzebne jest do tego kilka PCR- sekwencjonowanie- wykrywanie mutacji w wybranym genie- sekwencjonowanie

Określenie ilości transkryptu- zajmujemy się RNA!:

Określenie poziomu ekspresji genów w różnych tkankach- izolacja RNA, odwrotna transkrypcja do cDNA. Amplifikacja fragmentów badanego cDNA metodą PCR w celu zbadania poziomu ekspresji genów/ relatywnej ilości analizowanego tran skryptu- wyniki półilościowego RT-PCR

Reakcje PCR prowadzi się tylko na DNA! (polimerazy DNA nie będą działały na RNA)

Jeśli mamy do czynienia z RNA to musimy za pomocą odwrotnej transkryptazy zamienić go w cDNA :

0x08 graphic
RNA odwrotna transkryptaza DNA ( nazywane cDNA) * cDNA= mRNA bez uracylu

W badaniu poziomu ekspresji genu musimy dodać 4 startery : 2 normalne i 2 do aktyny (house-keeping gene = gen metabolizmu podstawowego, nie zawsze jest to aktyna)

InACT-4: wynik badania poziomu ekspresji aktyny
In2TL- badanie poziomu ekspresji genu badanego

Półilościowy- bo dokładnie nie można określić ilości genu, wynik podaje się w odniesieniu do aktyny

RT-PCR (real time PCR)- ilościowy PCR

+ polimeraza DNA
+ dATP, dGTP, dCTP, dTTP



Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Cytologia-ćw-8.04.2011, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, Cytologia
CYTOLOGIA-cw5, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, Cytologia
cyto wejścia 2010, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, Cytologia
Barwienie w cytodiagnostyce, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, Cytologia
cytologia moczu, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, Cytologia
cytologia - w I - 25.03, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, Cytologia
co to sonda i jak ja znakujemy, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, Cytologia
koło1-materiał, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, Immunologia, Immunohematologia
chemia kliniczna-wykad 2, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, chemia kliniczna, semestr V
lKoło, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, chemia kliniczna
Chemia kliniczna 20.12.2010, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, chemia kliniczna, semestr V
koło, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, chemia kliniczna
lista na egzamin-1, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, biochemia kliniczna, biochemia kliniczna
2010-Pytania otwarte, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, analiza instrumentalna
koło białka 2010, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, chemia kliniczna, koło białak osocza
7.Czy możliwa jest rejestracja czystych widm elektronowych, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, analiza
pytania na chemie lipidy, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, chemia kliniczna
Chemia kliniczna - 18.10, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, chemia kliniczna, semestr V
Wykład 22, BIO, Diagnostyka Laboratoryjna, chemia kliniczna

więcej podobnych podstron