NIETYPOWE GENY, NIETYPOWE PROCESY

"(...) a jednak jeśli już wiedzieć chcesz, nie takie to proste (...)"
Budka Suflera "Nie taki znów wolny"

Cel:

Niniejszy dział ma za zadanie przedstawić mało znane, a ciekawe zjawiska z zakresu genetyki i biologii molekularnej, wykraczające poza materiał powszechnie znany i wykładany.

W odróżnieniu od pozostałych działów podręcznika, ten ma charakter "ciekawostkowy" tzn. stanowi przegląd różnych procesów zachodzących na poziomie genów, a powiązanych jedynie ideą przedstawienia czegoś spoza kanonu.

• MATERIAŁ GENETYCZNY KOMÓRKI Z ZAŁOŻENIA NIE JEST NIEZMIENNY

• SOMATYCZNE REARANŻACJE W UKŁADZIE IMMUNOLOGICZNYM

• TRANSPOZONY - WĘDRUJĄCE DNA

• WŁADCY I PODDANI - KONTROLA GENÓW NAD GENAMI

• PŁEĆ ZALEŻY OD GENÓW, NIE OD CHROMOSOMU

• DETERMINACJA PŁCI U SSAKÓW

• TA NIESAMOWITA TRYPANOSOMA!

• TO JESZCZE NIE WSZYSTKO !

MATERIAŁ GENETYCZNY KOMÓRKI Z ZAŁOŻENIA NIE JEST NIEZMIENNY

Materiał genetyczny komórki ma stanowić stabilny i, wydawałoby się, niezmienny zbiór informacji o budowie i funkcjonowaniu komórki.

W rzeczywistości jednak DNA komórki (i organizmu) ulega w czasie życia wielu, czasem bardzo znaczącym przemianom.

Czynniki środowiska i błędy aparatu komórkowego związanego z replikacją i ekspresją materiału genetycznego prowadzą do powstawania mutacji (link do A. Zakrzewskiej - dodatek)

W przyrodzie zdarzają się również sytuacje, gdzie zmiany w DNA wprowadzane są celowo i są z góry zaplanowane.

SOMATYCZNE REARANŻACJE W UKŁADZIE IMMUNOLOGICZNYM

Unikalne zjawiska tego typu zachodzą w układzie immunologicznym (odpornościowym) kręgowców. Jego podstawową funkcją jest obrona organizmu przed atakującymi go mikroorganizmami. Musi szybko i sprawnie rozpoznać zagrażający organizmowi patogen i zlik widować go.

Można sobie wyobrazić, jak niezwykle trudne jest to zadanie.

Znamy ogromnie wiele patogenów i wciąż odkrywa się nowe. Wirusy, grzyby, pierwotniaki, robaki ...

Na dodatek mikroorganizmy ewoluują najszybciej spośród całego świata żywego (link - ewolucja molekularna) Niezwykle wysokie tempo tych przemian podnosi jeszcze wymagania stawiane układowi immunologicznemu, zmuszając go do swoistej "pogoni" za mutuj ącymi patogenami. Musi on być przygotowany nawet na odparcie ataku nie istniejących jeszcze szczepów bakterii czy wirusów.

Biologów od dawna intrygowała ta zdolność organizmu do odpowiedzi na praktycznie nieograniczoną liczbę antygenów.

Sekret skutecznej obrony przed inwazją patogenów tkwi przede wszystkim w szybkiej i precyzyjnej identyfikacji przeciwnika. Służą temu między innymi przeciwciała, czyli immunoglobuliny (Ig). Każde przeciwciało posiada zdolność do wiązania specyficzn ego dla siebie antygenu.

Skoro jednak organizmowi zagraża tak wiele różnych mikroorganizmów, to jak nasz układ immunologiczny jest w stanie wytworzyć odpowiednią ilość przeciwciał ?

Próbowała to wyjaśnić "teoria informacyjna" Paulinga i Horowitza, która zakładała, że organizm, który nie zetknął się jeszcze z danym antygenem, nie zawiera komórek ani przeciwciał zdolnych do jego swoistego rozpoznania. Zgodnie z tą hipotezą antyg en odkształcałby nieczynną immunoglobulinę, aktywując ją i dostosowując do swojej struktury przestrzennej. Rozważano też możliwość oddziaływania antygenu na gen kodujący łańcuchy białkowe przeciwciała.

Teoria ta okazała się jednak sprzeczna z rezultatami doświadczeń. Wykazano w nich, między innymi, że w mieszaninie limfocytów B pobranych od dawcy, który nigdy nie zetknął się z danym antygenem, znajdują się komórki zdolne do swoistego rozpoznania tego właśnie antygenu i produkcji odpowiednich przeciwciał !

Później zbadano, że organizm wytwarza około 108 - 109

(1 000 000 000 ) rodzajów przeciwciał (!). Liczba ta jest jeszcze bardziej zaskakująca, gdy uświadomimy sobie, że cały genom człowieka zawiera prawdopodobnie tylko około 105 (100 000) genów kodujących białka! Prosty schemat syntezy białka: DNA (R) RN A (R) BIAŁKO nie dostarcza odpowiedzi na pytanie o źródło takiej różnorodności immunoglobulin. Wytłumaczeniem okazało się odkrycie somatycznych rearanżacji genomu limfocytów odpowiedzialnych za wytwarzanie immunoglobulin.

Aby zrozumieć ten niezwykły proces przyjrzyjmy się najpierw budowie pojedynczego przeciwciała.

Dla ułatwienia immunoglobulinę przedstawiamy schematycznie w kształcie litery "Y".

Fragment Fc przeciwciała umożliwia łączenie się immunoglobulin w większe agregaty - dimery, pentamery itp., a także kotwiczenie przeciwciała w błonie komórkowej. Jest też odpowiedzialny za aktywowanie innych składników odpowiedzi immunologicznej. F ragment Fab (antigen binding) immunoglobuliny odpowiada za specyficzne wiązanie antygenu.

Geny kodujące łańcuchy polipeptydowe składające się na przeciwciało znajdują się u człowieka na chromosomach 2, 14 i 22.

Procesy, które prowadzą do tak niezwykłej różnorodności przeciwciał, najlepiej można przedstawić na przykładzie syntezy łańcucha ciężkiego Ig, którego gen u człowieka umiejscowiony jest na chromosomie 14.

Ogromna większość genów Eucaryota jest nieciągła (linki do rozdz. Eucaryota). Także i geny kodujące immunoglobuliny nie są tu wyjątkiem. Egzony kodujące części łańcucha polipeptydowego porozdzielane są fragmentami DNA nie niosącego żadnej infor macji (a osiągającymi długość do 8 tysięcy par zasad !). Jednak to nie nieciągłość genu stanowi o unikalnym charakterze zjawiska syntezy przeciwciał.

Niezwykłą cechą genu łańcuchów przeciwciał jest występowanie obok siebie wielu, nieznacznie się od siebie różniących, kopii danego egzonu.

Gen fragmentu ciężkiego immunoglobuliny wyglądać będzie mniej więcej tak:

 

Forma genu dla łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, pokazana powyżej, nie występuje jednak w dojrzałych limfocytach, zdolnych do wytwarzania Ig. Znaleźć ją można między innymi w komórkach płciowych i niezróżnicowanych komórkach macierzystych, stąd t a forma genu nosi nazwę zarodkowej.

W dojrzewającym limfocycie B zachodzi niezwykły proces somatycznej rekombinacji polegający na przegrupowaniach w DNA kodującym łańcuch Ig. Rekombinacje te prowadzą do wytworzenia funkcjonalnych genów immunoglobulinowych.

Pierwsze przegrupowanie w obrębie obszaru kodującego łańcuch ciężki przeciwciała prowadzi do połączenia jednego z segmentów D z jednym z segmentów J. Odbywa się to najczęściej poprzez wypętlenie nici i delecję fragmentu DNA dzielącego łączone segme nty.

W następnym etapie dochodzi do łączenia powstałej sekwencji DJ z jednym z egzonów z grupy V.

Wycinanie odcinków DNA pomiędzy segmentami i łączenie odpowiednich segmentów zachodzi przy udziale rekombinaz - słabo dotąd poznanych enzymów, aktywnych jedynie w rozwijających się limfocytach.

Rekombinaza rozpoznaje tzw. "sekwencje sygnałowe" znajdujące się na końcach segmentów (egzonów). Umożliwia to precyzyjne połączenie się tylko jednego segmentu D z jednym z segmentów J, jednym z segmentów V, a później z jednym z segmentów grupy C, d ecydującym o przynależności do klasy przeciwciał.

Dodatkową ciekawostką może być fakt, że egzony z poszczególnych rodzin (V,D,J), nie są wybierane całkowicie losowo, tak, jak to początkowo przypuszczano. W procesie rekombinacji preferowane są np. egzony V leżące bliżej segmentów J (u człowieka prz ykładem mogą być segmenty VH6

i VH26) Podobne zjawisko zaobserwowano dla segmentów J i D. Przyczyna takiego zjawiska, ograniczającego przecież różnorodność produkowanych przeciwciał, nie została dotąd dokładnie zbadana. Przypuszcza się jednak, że preferowane kombinacje egzonów umoż liwiają wytworzenie przeciwciał o kluczowej dla bezpieczeństwa organizmu swoistości.

Omówione do tej pory mechanizmy prowadzące do różnorodności przeciwciał pozwalają na wytworzenie najwyżej około 105 Ig o różnej swoistości. Znacznie większe rzeczywiste bogactwo immunoglobulin ma swe źródło w innych jeszcze procesach. Jednym z bard ziej niezwykłych jest zmienność na złączach.

Ten typ zmienności jest rezultatem braku precyzji przy łączeniu poszczególnych segmentów V, D i J i przy wycinaniu znajdującego się pomiędzy nimi DNA. Przy formowaniu złącza pomiędzy egzonami może dojść do delecji nawet do 20 nukleotydów. Ale nie t o jest najciekawsze.

Na złączach między składanymi segmentami dochodzi bowiem do insercji dodatkowych (do 15) nukleotydów. Proces dołączania nowych nukleotydów ZACHODZI BEZMATRYCOWO !!! Oznacza to tworzenie "nowego genu", nie istniejącego w komórce zarodkowej, w sposób całkowicie przypadkowy - "z powietrza" ! Za to niesamowite zjawisko odpowiedzialna jest transferaza nukleotydów terminalnych (TdT). Tak powstałe odcinki DNA na złączach nazywamy regionami N.

Unikalnym procesem, zwiększającym jeszcze liczbę wariantów Ig, jest przyłączanie do złącza krótkich (5-7 bp) oligonukleotydów wycinanych podczas innych rekombinacji. To zjawisko bywa nazywane "chwytaniem oligonukleotydów".

Szacuje się, że procesy związane ze zmiennością na złączach zwiększają liczbę wariantów Ig o dalsze dwa rzędy wielkości.

Nasz układ immunologiczny, w obronie przed patogenami, wytworzył jeszcze inne metody zwiększające pulę produkowanych przeciwciał.

Bardzo wydajnym procesem są mutacje somatyczne. Zachodzą one we fragmentach genu kodujących rejon zmienny łańcucha ciężkiego i lekkiego Ig. Do indukcji mutacji dochodzi w limfocycie B pobudzonym przez kontakt z antygenem. Omawiane mutacje są najczę ściej mutacjami punktowymi, rzadziej zdarzają się delecje czy insercje. Jedną mutację obserwuje się na ok. 10 000 komórek spośród jednej generacji. Jest to częstotliwość olbrzymia, około milion razy większa niż w przypadku mutacji spontanicznych w innych genach ! W wyniku tego procesu dochodzi do wymiany nawet do 1% nukleotydów w egzonach dla części zmiennych ciężkich i lekkich łańcuchów Ig.

Mutacje te mogą prowadzić do zwiększenia powinowactwa do antygenu nawet o 100 razy i zwiększają liczbę wariantów o kilka rzędów wielkości !

Na ogromną różnorodność wariantów przeciwciał wpływa również fakt, że poza łańcuchami ciężkimi, których syntezę opisaliśmy powyżej, składają się one również z łańcuchów lekkich, przy których powstawaniu zachodzą niezależnie podobne procesy.

Dzięki tak wyrafinowanym metodom ekspresji genów Ig, organizm może wytwarzać imponującą liczbę przeciwciał o różnej swoistości. Przy wykorzystaniu stosunkowo skromnej liczby genów immunoglobulinowych, pula przeciwciał mogłaby osiągnąć około 1011 =1 00 000 000 000 ! Liczba ta mogłaby jeszcze wzrosnąć, gdyż przy rachunku nie wzięto pod uwagę trudnej do oszacowania, a niezwykle wydajnej, zmienności mutacyjnej.

Układ immunologiczny człowieka wypracował sobie wydajny system obrony przed zagrożeniem ze strony chorobotwórczych mikroorganizmów. Płaci jednak wysoką cenę za zwycięstwo w wyścigu z niezwykle zróżnicowanym i szybko mutującym przeciwnikiem. Niezwyk le drastyczne i ryzykowne metody: indukowanie mutacji, niedokładny splicing, czy bezmatrycowa synteza DNA muszą wywoływać również negatywne skutki.

Szacuje się, że około 80% rekombinacji powstałych dzięki zmienności na złączach jest nieproduktywne (!) tj. nie prowadzi do syntezy czynnego łańcucha. Zmienia się bowiem ramka odczytu, triplety nukleotydów kodują inne aminokwasy, lub powodują powstawanie krótszego produktu. Somatyczne mutacje mogą równie dobrze zwiększać powinowactwo (siłę wiązania antygenu), jak i prowadzić do całkowitej jego utraty.

Powstanie limfocytu produkującego nieprawidłowe, nieczynne przeciwciała, lub nie wytwarzającego ich wcale nie jest jeszcze tak niebezpieczne. Może bowiem dojść do sytuacji, że limfocyt, na skutek somatycznych rearanżacji zacznie wytwarzać przeciwci ała skierowane przeciwko własnym antygenom!

W normalnych warunkach, jeszcze w życiu płodowym, zachodzi selekcja i eliminacja limfocytów B produkujących przeciwciała rozpoznające własne antygeny komórkowe. Proces ten odbywa się w szpiku kostnym. Podobne zjawiska, zachodzące w grasicy, powoduj ą likwidację limfocytów T zdolnych do atakowania antygenów własnego organizmu.

Jednak na skutek niedokładnej eliminacji wymienionych powyżej komórek, lub podczas pobudzenia układu immunologicznego wywołanego infekcją, układ odpornościowy może zwrócić się przeciwko własnym komórkom i tkankom.

Proces ten, nazywany autoagresją, może prowadzić do ciężkich chorób autoimmunologicznych. Przykładem takich schorzeń może być choroba Gravesa-Basedova, w której autoantygenem są receptory dla tyreotropiny zlokalizowane w tarczycy. W stwardnieniu ro zsianym organizm produkuje autoprzeciwciała skierowane przeciwko zasadowemu białku mieliny, tworzącemu osłonki komórek nerwowych. Częstą chorobą autoimmunologiczną jest cukrzyca typu I, w której organizm atakuje własne komórki ( trzustki.

Również niektóre nowotwory są ceną płaconą za sprawność układu odpornościowego przykładem może być chłoniak Burkitta, choroba występująca najczęściej w Afryce, w której dochodzi do przeniesienia protoonkogenu c -myc (tu 2 oddzielne linki) z 8 chrom osomu, w niezwykle aktywne transkrypcyjnie miejsce genów immunoglobulinowych na chromosomie 14. Dochodzi do nadekspresji protoonkogenu, przekształcenia go w onkogen, zaburzeń cyklu komórkowego i w efekcie do procesu nowotworowego.

TRANSPOZONY - WĘDRUJĄCE DNA

Zmiany mutacyjne w genomach organizmów zachodzą stosunkowo rzadko. Skomplikowane, wielostopniowe mechanizmy stoją na straży stabilności składu genetycznego komórki. Zdarzają się jednak w przyrodzie przypadki, że w genomach zarówno Pro -, jak i Eucaryota dochodzi do przemieszczania się fragmentów DNA osiągających nawet kilkadziesiąt tysięcy par zasad (!).

Takie ruchome elementy genetyczne, zmieniające swą lokalizację w obrębie genomu, odkryto w latach 50 i nazwano TRANSPOZONAMI.

Z przemieszczaniem się transpozonów mogą być związane bardzo poważne zmiany w DNA: delecje, inwersje i duplikacje obejmujące bardzo nieraz obszerne rejony i powodujące nieraz utratę funkcji niektórych genów, a wzmożoną ekspresję innych. Co jednak u możliwia transpozycję, czyli wędrówkę transpozonów przez geny?

Spróbujmy przyjrzeć się transpozonowi z grupy IS - najprostszych transpozonów bakteryjnych. Transpozon IS1 występuje u E. coli i ma długość zaledwie 768 par zasad. Koduje on specyficzną nukleazę, zwaną transpozazą. Na obu końcach tego transpozonu z najdują się krótkie, niemal identyczne, lecz przeciwnie skierowane 23- nukleotydowe sekwencje ITR.

Transpozaza rozpoznaje obie sekwencje terminalne, a także krótką (dla IS1 9 par zasad) sekwencję akceptorową (docelową) w genomie gospodarza. Transpozaza nacina obie nici na końcach transpozonu i w obrębie sekwencji docelowej, tworząc lepkie końce. Podczas następującego później wbudowywania transpozonu następuje podwojenie sekwencji akceptorowej tak, że w efekcie IS1 w nowym położeniu jest oflankowany przez dwie sekwencje docelowe.

W procesie transpozycji niezbędne są też enzymy gospodarza: polimeraza I DNA i ligaza.

Sekwencja transpozonowa włączona w obrębie genu gospodarza powoduje najczęściej jego inaktywację. Ponadto rekombinacja pomiędzy dwiema kopiami tej samej IS wbudowanymi w różnych miejscach genomu może doprowadzić do zmian w ilości lub orientacji gen ów gospodarza.

Ponieważ gen transpozazy jest opatrzony własnym promotorem, to wbudowanie transpozonu może też wywołać wzmocnienie ekspresji sąsiadujących genów.

Transpozony przyczyniają się więc do znacznie częstszych rearanżacji genomu, niż np. mutacje punktowe. Mutanty transpozonowe są jednak nietrwałe i często rewertują.

W przyrodzie występują również transpozony znacznie większe i bardziej skomplikowane od czynników insercyjnych. Niektóre z nich przedstawione są w poniższej tabeli:

NIEKTÓRE TRANSPOZONY BAKTERYJNE I ORGANIZMÓW EUKARIOTYCZNYCH
Symbol elementu	Liczba par zasad	Gatunek, w którym występuje transpozon	Uwagi
IS1	768	E. coli K12	koduję transpozazę
Tn5	5700	E. coli, plazmid R	zawiera gen oporności na kanamycynę
AC	4563	kukurydza	powoduję pękanie chromosomów jako niekompletny element D1
Tc1	1610	Caenorhabditis elegans
P	2900	D. melanogaster	wywołuje zaburzenia linii komórek płciowych
RETROTRANSPOZONY
Ty	5600	drożdże	transpozycja przez mRNA i odwrotną transkrypcję na DNA
copia	5000	D. melanogaster	transpozycja przez mRNA i odwrotną transkrypcję na DNA

Uwidoczniona jest tu różnorodność form "wędrującego DNA": od krótkich, jak opisany IS1, do kilkudziesięciokilobazowych gigantów. Od przenoszących się jedynie z miejsca na miejsce, po posiadające zdolność do transpozycji replikatywnej, tj. wytwarzaj ących swoją kolejną kopię, która wbudowuje się w inne miejsce w genomie. Od kodujących samą tylko transpozazę do tzw. transpozonów złożonych. Niosą one dodatkowo geny oporności na wiele antybiotyków, wykazują złożony system kontroli ekspresji, czasem kodu ją geny odwrotnej transkryptazy, proteazy i Rnazy.

Niektóre transpozony, aby się powielić i wbudować w nowe miejsce w genomie, muszą zostać przetranskrybowane na mRNA, a dopiero później, przy udziale kodowanej przez nie odwrotnej transkryptazy, są przepisywane z powrotem na DNA. Dzieje się tak np. w przypadku drożdżowych retrotranspozonów Ty, czy transpozonowych elementów copia u Drosophila melanogaster.

Takie procesy, jak i wiele sekwencji zbliżonych do wirusowych, są być może śladem wskazującym na pochodzenie retrotranspozonów od retrowirusów, a "klasycznych" transpozonów od wirusów DNA.

Niektórzy naukowcy lansują hipotezę, że transpozony są po prostu dawnymi wirusami, które utraciły geny odpowiedzialne za zjadliwość. Transpozony nigdy bowiem nie występują poza komórką, jako cząstki zdolne do infekcji i chorobotworzenia.

Zdolność transpozonów do aktywnego wbudowywania się w genom gospodarza wykorzystuje współczesna biologia molekularna i biotechnologia. Geny zawarte w transpozonie można przecież zastąpić innymi, wykorzystując transpozon jako wydajny wektor. Transpo zon może też zostać użyty jako sonda molekularna do lokalizowania poszukiwanych sekwencji DNA.

WŁADCY I PODDANI - KONTROLA GENÓW NAD GENAMI

Analizując rozwój wielokomórkowego organizmu, można się zastanawiać, dlaczego właściwie komórki zarodka, zawierające tę samą informację genetyczną, różnicują się w twory tak nieraz od siebie inne.

Co sprawia, że ten mechanizm jest powtarzalny i tak niezwykle precyzyjny?

Genetyka rozwoju jest dziedziną stosunkowo młodą, stąd nie znamy jeszcze odpowiedzi na wiele stawianych przez nią pytań. Kolejne odkrycia dostarczają wciąż nowych informacji. W 1997 roku ogłoszono sensacyjną (ale przyjętą bardzo sceptycznie i z rez erwą) wiadomość o sklonowaniu owcy Dolly.

Najbardziej niezwykłym elementem tego eksperymentu (a pomijanym niemal przez media) było stwierdzenie, że komórki ssaków nie są nieodwracalnie zróżnicowane, czyli, że posiadają komplet sprawnych genów,

w których zawarta jest informacja o całym organizmie. Potwierdziło to tezę, że w specjalizujących się komórkach najczęściej nie dochodzi do nieodwracalnego unieczynnienia genów, (np. przez silną spiralizację chromatyny), lecz do ich selektywnej, kontro lowanej ekspresji.

Ponieważ morfogeneza odbywa się według wzorców przekazywanych przez rodziców, muszą istnieć geny odpowiedzialne za kontrolę rozwoju.

Ich mutacje miałyby łatwo zauważalne, poważne następstwa, w postaci zaburzeń budowy osobnika. Prawidłowe anatomicznie organy pojawiałyby się w nieodpowiednim dla nich miejscu, liczbie, czy czasie.

Znaleziono tego typu mutanty u znanych organizmów laboratoryjnych - nicienia Ceanorhabditis elegans i muszki owocowej Drosophila melanogaster.

Ceanorhabditis elegans jest niewielkim zwierzęciem, długości zaledwie 1,2 mm.

Jego rozwój trwa tylko 3 dni, a jego specyficzną cechą jest to, że ciało dorosłego osobnika składa się dokładnie z 945 komórek, których podziały i migracje w okresie rozwoju osobnika zostały dokładnie zbadane (!)

Genom tego nicienia zawiera zaledwie ok. 3 tys. genów i został już w całości sklonowany. Dzięki mutacjom zidentyfikowano ok. 800 genów odpowiedzialnych za rozwój. Mutacje w tych genach powodują, że komórka rozwija się w tym kierunku, co powinna, al bo nie zatrzymuje się w podziałach w odpowiednim momencie.

Analiza mutantów pomogła w identyfikacji genów nadzorujących rozwój także u Drosophila melanogaster. Mutacje rozwojowe, zaburzające symetrię ciała, zmieniające liczbę segmentów, ich wygląd i położenie, pozwoliły na zlokalizowanie ok. 100 genów zaan gażowanych w kontrolę prawidłowego rozwoju owada.

Geny te tworzą ścisłą hierarchię, w której geny wyższej kategorii regulują aktywność genów podrzędnych.

Najwyższą pozycję w hierarchii układu regulacyjnego zajmują geny polarności jaja, odpowiedzialne za orientację przedniej i tylnej części jaja, a w konsekwencji również za wykształcenie osi przód- tył zarodka i dorosłego osobnika. Produkty tych genó w są syntetyzowane jeszcze w organizmie samicy, a następnie zdeponowane w postaci mRNA w oocycie. Białko pierwszego z nich: genu bicoid wyznacza przedni koniec ciała i jego stężenie maleje ku tyłowi jaja. Tylna część jaja wyznaczana jest przez rosnące ku tyłowi stężenie produktu innego z "królujących" genów: nanos.

Białko genu bicoid jest czynnikiem transkrypcyjnym, i wraz z białkiem nanos dostarcza sygnału, regulującego aktywność genów niżej położonych w hierarchii.

Dalsze geny rozwoju to czynniki umożliwiające segmentację tworzącego się zarodka. W tej grupie działają najpierw geny powodujące podział ciała na 3 duże rejony, a następnie kaskada genów, o coraz bardziej lokalnym, ale za to bardziej precyzyjnym dz iałaniu. Najniżej w hierarchii położone geny z tej grupy wyznaczają już ułożenie wewnątrz poszczególnych segmentów.

Najniższą, choć również niezwykle znaczącą, pozycję w kaskadzie genów regulatorowych zajmują tzw. geny homeotyczne. nadzorują one specjalizowanie się segmentów i wykształcanie charakterystycznych dla nich narządów. Główne geny homeotyczne występują u Drosophila w dwóch głównych kompleksach: Antennapedia (ANT-C), wyznaczającym różnicę pomiędzy segmentem głowowym a segmentami tułowiowymi, oraz w kompleksie bithorax (BX-C), odpowiedzialnym za różnice między tułowiem i odwłokiem.

Mutacje w obrębie tych genów wywołują znaczące, choć nie letalne, zaburzenia. Mutacja Antp sprawia, że zamiast czułka, na głowie muszki wyrasta odnóże, zaś mutacja bx powoduje zamianę części segmentu odwłokowego na tułowiowy, wskutek czego rodzi si ę mucha z dodatkową parą skrzydeł.

Wiele z genów zawiadujących rozwojem koduje sekwencję nazywaną homeobox. Jest to fragment o długości ok. 180 par zasad, kodujący domenę białkową zdolną do wiązania się z DNA. Ta HOMEODOMENA zbudowana jest z trzech fragmentów (- helikalnych, tworząc ych strukturę nazywaną "heliks- skręt-heliks".

Obecnie wiadomo, że homeodomena jest składnikiem białek o charakterze czynników transkrypcyjnych, wiążących się z DNA i regulujących ekspresję innych genów.

Homeodomena jest niezwykle silnie konserwowana ewolucyjnie. Geny kodujące te domeny wykazują bardzo wysoką homologię, nawet, gdy pochodzą od bardzo odległych od siebie gatunków.

A - mysz,    B - żaba,    C - muszka owocówka    D - drożdze

Za badania poświęcone wczesnym etapom powstawania zarodka i odkrycie funkcji homeodomeny została przyzna w 1995 roku Nagroda Nobla.

Jak niezwykle sprawny i wydajny jest to czynnik, skoro został utrwalony przez ewolucję i dziś możemy go znaleźć min. u drożdży, Drosophila, człowieka, myszy, a nawet, ku zdumieniu genetyków, u kukurydzy !

Co więcej, nie tylko sama sekwencja homeobox jest powielana w ewolucji, ale i cały hierarchiczny system regulujący tworzenie się zarodka.

Podobne układy genów homeotycznych i obszarów ich aktywności można stwierdzić np. u Drosophila i u kręgowców!

Hierarchiczny układ genów, przywodzący na myśl układ władca-poddany, pokazuje możliwość "panowania" stosunkowo nielicznej grupy genów nad pozostałymi. Czy jednak organizmy, zbudowane na podstawie informacji zawartej w DNA, również są tylko kolejnym i sługami wszechwładnych genów?

Taką kontrowersyjną hipotezę wysunął w 1976 Richard Dawkins, profesor biologii na uniwersytecie w Oxfordzie. W swej słynnej książce "Samolubny gen" ("The Selfish Gene"). Twierdzi on, że, podobnie jak inne istoty żywe, jesteśmy jedynie maszynami pow ołanymi do życia przez geny. Naszym zadaniem jest jedynie zapewnić nieśmiertelnym, wiecznym genom możliwość wytworzenia kolejnych kopii. Ewolucja produkowałaby więc jedynie coraz doskonalsze opakowania...

Jak Wam się to podoba ?

PŁEĆ ZALEŻY OD GENÓW, NIE OD CHROMOSOMU

Jest rzeczą powszechnie znaną, że za naszą płeć odpowiedzialny jest chromosom Y, lub jego brak. Na pozór jest to fakt oczywisty i, w gruncie rzeczy, niezbyt interesujący. Problem pojawia się dopiero wtedy, gdy uświadomimy sobie, że za cechy odpowiedzialne są geny lub ich grupy, a chromosom jest tylko pewnym wygodnym sposobem ich upakowania.

A więc, szczęśliwi posiadacze "igreka" i dumne właścicielki dwóch "iksów", poszukajmy genu odpowiedzialnego za różnicowanie się płci.

Ponieważ rozdzielnopłciowość występuje już u stosunkowo prostych organizmów, na nich właśnie skupiła się uwaga badaczy. Proste organizmy modelowe miały dostarczyć danych do badań nad determinacją płci u ssaków, a wśród nich i człowieka. Mechanizmy molekularne prowadzące do różnicowania się płci zostały najlepiej poznane u nicienia Caenorhabditis elegans i u ulubionej przez genetyków Drosophila melanogaster.

U tej sympatycznej muszki , podobnie jak u człowieka, samice mają dwa chromosomy X, a samce kombinację XY. Co ciekawe, o płci zwierzęcia nie decyduje bezpośrednio obecność lub brak chromosomu Y czy X, a stosunek liczby chromosomów X do liczby haploidalnych kompletów autosomów. U normalnego samca stosunek X/A wynosi 1/2 - jeden chromosom X na dwa (u diploidalnej Drosophila) komplety autosomów.

U normalnej samicy ten stosunek wynosi odpowiednio 1.

Niezwykle ciekawy efekt osiągano krzyżując osobniki o różnej ploidalności. Udało się osiągnąć szerokie spektrum wartości stosunku X/A.

Pozwoliło to na odkrycie wartości progowej X/A=0,67, poniżej której różnicują się samce, zaś powyżej której - samice. Osobniki wykazujące współczynnik równy 0,67 (dwa chromosomy X i trzy komplety autosomów) były tzw. interseksami i posiadały zarówno komórki męskie, jak i żeńskie.

Do tej pory nie wiadomo jeszcze, w jaki sposób organizm, a dokładniej jego pojedyncze komórki, mierzy ilość chromosomów. Przypuszcza się, że na chromosomach X znajdują się geny kodujące białka o charakterze czynników transkrypcyjnych (sis-a i sis-b), które po przekroczeniu wartości progowej (związanym z ilością chromosomów X) powodują feminizację. Wciąż nie znany jest natomiast gen zlokalizowany na autosomach, a wpływający na różnicowanie płci.

Wspomniane już produkty genów sis-a i sis-b aktywują nadrzędny gen regulatorowy Sxl inicjując kaskadę genów biorących udział w różnicowaniu się płci u Drosophila.

Powyższy schemat ilustruje trzy kierunki regulującego działania genu Sxl: aktywacja kaskady genów odpowiedzialnych za determinację płci komórek somatycznych, odrębny szlak prowadzący do determinacji płci komórek rozrodczych i wreszcie aktywację mechanizmów kompensacyjnych.

Mechanizm kompensacyjny, nie związany bezpośrednio z procesem determinacji płci, pozwala na wyrównanie dysproporcji pomiędzy ilością genów na chromosomie X u samca (XY) i u samicy (XX). Na chromosomie X, poza czynnikami płci, znajduje się bowiem jeszcze ok. jednej piątej wszystkich genów Drosophila. U tej muszki, w celu wyrównania u samca poziomu ekspresji genów z chromosomu X do poziomu występującego u samicy, zachodzi dwukrotnie wydajniejszy proces transkrypcji.

Zjawisko kompensacji zachodzi również u innych organizmów, w tym i u człowieka. W jądrze interfazowym normalnych komórek kobiecych jeden z chromosomów X przekształca się w silnie skondensowane, nieaktywne ciałko Barra. Rezultat takiej kompensacji jest identyczny jak u Drosophila - ekspresja genów zlokalizowanych na chromosomie X jest taka sama u obu płci, pomimo różnej liczby tych chromosomów. Inaczej dzieje się jedynie w żeńskich komórkach płciowych - oocytach - zachodzi tam aktywacja nieczynnego dotąd drugiego chromosomu X.

U osobników euploidalnych , ze zwielokrotnionym chromosomem X, dochodzi do inaktywacji wszystkich, oprócz jednego, chromosomów X w komórkach.

Jak już wspomniano, chociaż kompensacja jest zjawiskiem kontrolowanym przez gen Sxl, to jest jednak jedynie pośrednio związana z genetyczną determinacją płci.

Gen ten bowiem ma inną funkcję - znacznie istotniejszą, jeśli chodzi o determinację płci - aktywuje u Drosophila melanogaster kaskadę podrzędnych genów, powodujących rozwój organizmu w kierunku płci żeńskiej.

U samców muszki owocowej, w okresie postembrionalnym, również zachodzi transkrypcja genu Sxl. Jednak ze względu na różnicę w obróbce mRNA u obu płci u samców powstaje krótszy, niefunkcjonalny produkt.

Determinacja płci somatycznej zależna jest od czterech genów regulatorowych podporządkowanych genowi Sxl: tra, tra-2, dsx i genu ix - niezbędnego, choć o wciąż nieznanej funkcji.

Mechanizm regulacji genów determinujących płeć somatyczną działa przede wszystkim na poziomie modyfikacji transkryptów. U samic funkcjonalne białko genu Sxl zawiera domenę wiążącą się z RNA, co wskazuje na jego rolę w obróbce mRNA. Rzeczywiście - umożliwia ono powstanie działającego produktu genu kolejnego z genów - tra. U samców, pozbawionych poprawnego produktu Sxl, w czasie obróbki transkryptu zostaje wycięty z genu tra obszerny fragment ORF, powodując powstanie nieczynnego produktu.

Białka genów tra i tra-2 również zawierają sekwencje kodujące domeny oddziaływujące z RNA. Są one zaangażowane w obróbkę transkryptu kolejnego genu - dsx, który daje zarówno funkcjonalny produkt męski (bez obróbki przez białko tra), jak i żeński. Decyduj[UDPP1]ą one o dalszym rozwoju komórek somatycznych odpowiednio w kierunku płci męskiej i żeńskiej. Cały szlak aktywowany przez gen Sxl ukazuje poniższy schemat:

Mechanizm różnicowania płci komórek rozrodczych (wytwarzania plemników lub oocytów) nie został jeszcze dokładnie poznany, chociaż zbadano już wiele genów zaangażowanych w proces gametogenezy. jednym z nich jest z pewnością omawiany już gen Slx, którego aktywność warunkuje powstawanie oocytów. Wiadomo również, że nie bez znaczenia jest wpływ komórek somatycznych o określonej płci - stwierdzono eksperymentalnie, że komórki płciowe XX przeniesione w otoczenie męskich komórek somatycznych, mogą wejść na drogę spermatogenezy.

DETERMINACJA PŁCI U SSAKÓW

U ssaków mechanizm determinacji płci związany jest z obecnością chromosomu Y, a nie, jak u Drosophila, liczbą chromosomów X. Ponadto płeć somatyczna jest u ssaków w znacznej mierze rezultatem działania układu hormonalnego, a więc zależy od płci gonad.

Czynnik warunkujący płeć męską, a znajdujący się właśnie na chromosomie Y, nazwano u człowieka TDF. Nadanie nazwy wyprzedziło o ponad trzydzieści lat jego rzeczywiste odkrycie, bowiem precyzyjna identyfikacja TDF na chromosomie była dość skomplikowana. Poszukiwania "genu płci" rozpoczęto od zbadania niepłodnych osobników płci męskiej, których komórki zawierały dwa chromosomy X i tych, którzy na skutek uszkodzeń chromosomu Y mieli płeć żeńską.

Pierwszym krokiem było zawężenie obszaru badań do okolic tzw. "rejonu pseudoautosomowgo" czyli niewielkiego, końcowego fragmentu krótkiego ramienia chromosomu Y, wykazującego homologię do chromosomu X. Osiągnięto to po analizie ano mali związanych z delecjami i translokacjami w chromosomie Y.

Następnie, gdy dysponowano już wieloma sondami dla chromosomu Y, określono, że poszukiwany gen TDF mieści się u człowieka w obrębie fragmentu DNA o długości około 280 000 par zasad (280 kB !) przylegającego do rejonu pseudoautosomowego.

Kiedy, po 28 latach badań, w obrębie tej sekwencji znaleziono gen kodujący czynnik transkrypcyjny o wielokrotnie powtarzającym się motywie "palców cynkowych" (nazwany ZFY), naukowcy byli już niemal pewni, że to właśnie poszukiwany gen TDF.

Jednak już po dwóch latach hipoteza, że gen ZFY jest genem determinującym występowanie płci męskiej u ssaków, upadła, ponieważ wykazano brak tego genu u niektórych mężczyzn nie posiadających chromosomu Y. Znaleziono u nich za to w chromosomie X fragment DNA o długości ok. 60 kB, pochodzący z odcinka bezpośrednio przylegającego do regionu pseudoautosomowego chromosomu Y.

Po kolejnym roku prac zawężono region poszukiwań do 35 000 par zasad. w tym właśnie obszarze znaleziono wreszcie gen, który do dziś uważany jest za właściwy TDF. Jest to niezwykle silnie konserwowana sekwencja 240 par zasad, nazwana SRY, kodująca domenę o zdolności wiązania się z DNA. Jest więc to, podobnie jak u Drosophila melanogaster, gen regulujący ekspresję kolejnych genów.

O tym, że gen SRY jest konserwatywny ewolucyjnie świadczy nie tylko jego występowanie w chromosomach Y wszystkich ssaków płci męskiej, ale i homologia do domeny białka Mc drożdży Schizosaccharomyces pombe, współodpowiedzialnej za wyznaczanie typów koniugacyjnych.

Ostatecznym potwierdzeniem, że gen TDY jest istotnie zaangażowany w determinację płci u ssaków, było doświadczenie wykonane w 1991 roku na myszach. Po wprowadzeniu do przedjądrza zapłodnionych jaj mysich genu Tdy (mysi odpowiednik TDY) wśród urodzonych zwierząt otrzymano kilka transgenicznych samców o kariotypie XX.

TA NIESAMOWITA TRYPANOSOMA!

Cóż może być niezwykłego w niewielkim, pasożytniczym pierwotniaku wywołującym na dodatek tak nieprzyjemną chorobę jak śpiączka ? (patrz: "W pustyni i w puszczy", H. Sienkiewicz) Ten świdrowiec, występujący we krwi zakażonych ssaków, a przenoszony przez muchę Tse-Tse, trapi mieszkańców Afryki i Ameryki Południowej oraz ich bydło. Nie to jest jednak przyczyną jego pojawienia się w tej pracy.

Trypanosoma brucei wykształciła sobie bowiem unikalny i niezwykle sprawny system chroniący ją przed atakiem ze strony układu immunologicznego. Jest to doskonały przykład wspominanego już dramatycznego wyścigu pomiędzy układem odpornościowym a pasożytami (link do mojego rozdziału o Ig) atakującymi organizm. Obie strony starają się "przechytrzyć" przeciwnika, wykształcając coraz to nowe metody obrony i ataku.

Na razie skuteczniejsza jest, niestety, Trypanosoma. Tylko jej dwa gatunki: T. cruzi i T. brucei występują u ponad 20 milionów ludzi, powodując śmierć niemal 70 tysięcy osób rocznie. O lat trwają badania nad wynalezieniem skutecznej szczepionki.

Świdrowiec wytworzył szereg mechanizmów chroniących go przed układem odpornościowym: wytwarzają proteazę odcinającą fragment Fc przeciwciał, produkują białko przyspieszające rozkład czynników niszczących obce cząsteczki w organizmie, umieją też wytwarzać kanały w błonie komórek żernych, uciekając z nich przed stawieniem.

Jednak najciekawszym przystosowaniem, z punktu widzenia genetyki

molekularnej, jest zjawisko PRZEŁĄCZANIA ANTYGENOWEGO.

Powierzchnia komórki Trypanosoma brucei pokryta jest gęstym płaszczem zbudowanym z glikoprotein VSG. Są one rozpoznawane przez układ odpornościowy, jako główny antygen pasożyta. Przeciwko nim uruchamiana jest odpowiedź immunologiczna i przeciwko VSG produkowane są przeciwciała.

Jednak w międzyczasie pierwotniak zmienia dotychczasowe glikoproteiny powierzchniowe, zastępując je innymi, o innej specyficzności antygenowej. Cały więc atak układu odpornościowego chybia celu.

Takie PRZEŁĄCZANIE ANTYGENOWE zachodzi wystarczająco szybko i często, by uciec przed posiadającym przecież ogromne zasoby układem immunologicznym. Ponadto genom Trypanosoma zawiera prawdopodobnie tysiące wersji genów VSG, co skazuje na niepowodzenie poszukiwania klasycznej szczepionki przeciw temu świdrowcowi, ponieważ każda szczepionka wywoła odporność przeciwko jednemu tylko, z wielu możliwych antygenów VSG.

Mechanizm takiej zmiany produkowanych glikoprotein musi być dość złożony, jeżeli wziąć pod uwagę następujące czynniki;

- komórka Trypanosoma jest znacznie większa i bardziej skomplikowana, niż komórka bakterii (również wykazujących zmienność antygenową)

- produkt genów VSG stanowią przynajmniej ok. 10% wszystkich białek wytwarzanych przez Trypanosoma. proces ten musi być więc niezwykle wydajny i zachodzić na dużą skalę

- zmiana antygenowości musi zachodzić relatywnie często, by w populacji pasożytów we krwi żywiciela pojawił się chociaż jeden osobnik o innych VSG od pozostałych, zanim układ immunologiczny zdoła zniszczyć wszystkie osobniki populacji

- osobniki wytwarzające nowe VSG nie mogą w żadnym wypadku wciąż wytwarzać poprzednich VSG, aby nie stać się obiektem ataku układu odpornościowego.

Za pomocą sond z mRNA dla VSG, wyizolowanych w różnych stadiach infekcji, zlokalizowano geny dla tych glikoprotein w genomie Trypanosoma.

Geny VSG odnaleziono w dwóch miejscach w genomie świdrowca: jako wielokrotnie powtórzone różne kopie w centralnej części chromosomów i jako pojedyncze kopie na końcach chromosomów (w odcinku telomerowym). Kopie telomerowe znaleziono dotąd w trzech różnych chromosomach (choć prawdopodobnie są też w innych).

Gen VSG ulegający aktualnie ekspresji był zlokalizowany właśnie na jednym z odcinków telomerowych. W danym momencie tylko jedna spośród kopii telomerowych ulega ekspresji, jednak mechanizm inaktywacji pozostałych nie został dotąd poznany. Być może opiera się on na zmianach stanu spiralizacji chromatyny.

Kilka tysięcy kopii (!) genu VSG umieszczonych wewnątrz chromosomu może ulec ekspresji tylko po duplikacji i przeniesieniu do miejsca telomerowego (prawdopodobnie na skutek bezpośredniej konwersji genu).

Badając mRNA pobrane z komórek Trypanosoma w różnych stadiach infekcji, stwierdzono, że wszystkie one, niezależnie od antygenowości, zaczynają się identyczną sekwencją złożoną z 35 par zasad. Co najciekawsze ani wyjściowa (śródchromosomalna ) kopia genu VSG, ani kopia przeniesiona do rejonu telomerowego, ani wreszcie samo miejsce aktywne transkrypcyjnie nie zawierają DNA tej 35 nukleotydowej sekwencji.

Skąd więc pochodzi ten "mini-egzon"?

W jednym ze zbadanych odcinków telomerowych, w którym zachodziła ekspresja na przestrzeni 550 kilobaz (550 000 par zasad !) nie znaleziono żadnej sekwencji podobnej do odnajdywanych w każdym z mRNA dla cząstek VSG.

Poszukiwane "mini-egzony" znaleziono za to w zupełnie innym, odległym miejscu genomu Trypanosoma w postaci około 200 tandemowo ułożonych kopii. Oznacza to, że transkrypcja kompletnego mRNA dla VSG jest nieciągła i transkrypt 35 -zasadowej sekwencji jest w jakiś sposób dołączany do transkryptu pozostałej części VSG.

Jedną z hipotez próbuje tłumaczyć to zjawisko występowaniem unikalnego mechanizmu TRANS-SPLICINGU (zobacz również: splicing). Polegałby on na łączeniu cząstek mRNA pochodzących z transkrypcji różnych, oddalonych od siebie fragmentów DNA.

TO JESZCZE NIE WSZYSTKO !

Ten krótki przegląd nie wyczerpuje w małym nawet stopniu niezwykłego bogactwa zaskakujących i ciekawych procesów związanych z genetyką molekularną. Brak miejsca nie pozwala na omówienie redagowania (editingu) transkryptu, podczas którego dochodzi do naprawdę niesamowitych, a nie zbadanych dotąd do końca zjawisk, takich jak: powtarzalne wstawianie lub usuwanie nukleotydów, czy zaplanowane delecje i insercje.

Nie było mowy o niezwykle ostatnio popularnych prionach - białkowych czynnikach infekcyjnych, które mogą się powielać, chociaż nie zawierają DNA !

Warto by też przyjrzeć się bliżej ciekawym procesom związanym z przełączaniem typów płciowych u drożdży, zbadać podobieństwo do przełączania genowego u Trypanosoma...

Wśród biologów można czasem usłyszeć powiedzenie, że przyroda składa się z samych wyjątków. Dzieje się tak również na poziomie "przyrody molekularnej".

---