Str w Lodiszu 237 (tylko zag. 13) poza tym różne i nie wiem jakie, bo reszta robiona jest gównie z pamięci i neta :P
Metody analizy ekspresji poszczególnych genów (białek) komórce
Ekspresję można analizować na kilku poziomach:
DNA
transkryptu RNA
obecności białka
Kontrolę DNA można przeprowadzić izolując całkowite DNA genomowe, przeprowadzając specyficzny PCR a następnie Southern blot z odpowiednio wyznakowaną komplementarną sondą.
Obecnie są dostępne chipy DNA pozwalające na szybką ocenę obecności genu w komórce.
Kontrolę transkryptu RNA przeprowadza się podobnie, ale izoluje się RNA, robi odwrotna transkrypcję a następnie PCR i Southern blot. Można tez po izolacji rozdzielić elektroforetycznie RNA całkowite i zrobić Northern blot.
Chipy są też dla RNA.
Metoda real time PCR pozwala na ilościową ocenę transkryptu.
Kontrolę obecności białka można przeprowadzić używając znakowanych przeciwciał np. w mikroskopie fluorescencyjnym, albo klasycznie robiąc ekstrakt i Western blot.
Metody analizy lokalizacji białek w komórce.
Generalnie polegają one na tym, że musimy cząsteczkę reporterową (barwnik fluorescencyjny, kuli złota do TEM) skoniugować z cząsteczką specyficzną np. przeciwciałem albo ligandem i wpuścić do komórki.
Dwie główne metody to barwienie fluorescencyjne na potrzeby mikroskopii konfokalnej, czyli:
a) przeciwciało pierwszorzędowe specyficznie rozpoznające szukane biało + przeciwciało drugorzędowe rozpoznające pierwszorzędowe i dodatkowo skoniugowane z barwnikiem fluorescencyjnym, można stosować kilka barwników dla detekcji wielu białek naraz. Można to robić in vivo, ale niektóre barwniki mogą być toksyczne dla komórek.
b) transfekcję komórki genem kodującym konstrukt szukanego białka + GFP albo jakieś inne fluoryzujące, ew. można użyć też konstruktu z lucyferazą, która utlenia lucyferynę i świeci. Metoda z lucyferazą pozwala dodatkowo na ilościową ocenę ilości szukanego białka. Można to robić in vivo.
Do mikroskopii elektronowej transmisyjnej (TEM) tez używa się przeciwciał, ale opłaszczonych białkiem A (jest to bakteryjne białko niespecyficznie wiążące przeciwciała) w kompleksie z kuleczkami złota (wielkości rzędu gdzieś 10-50nm). W miejscu gdzie przeciwciała zwiążą się z szukanym białkiem na mikrografii będzie widać czarne kropki, bo złoto jest gęste i mocno rozprasza elektrony. Stosując różnej wielkości kuleczki żeby zwizualizować różne białka naraz.
Przeciwciała monoklonalne i metoda ich uzyskania.
Przeciwciała monoklonalne to takie, które pochodzą od klonu jednego limfocytu B. Rozpoznają ten sam epitop z podobnym powinowactwem. Poliklonalne to takie które rozpoznają różne epitopy czyli w odniesieniu do jednego wykazują różne powinowactwa. Kiedy system immunologiczny takiej na przykład myszki albo królika zetknie się z obcym ciałem, np. białkiem, to limfocyty B aktywują się, klonują się i wytwarzają specyficzne przeciwciała. Problem w tym, że takie białko jest duże i ma dużo epitopów, więc i tych przeciwciał jest wiele rodzajów (są poliklonalne). Czasami jest to ok, ale do niektórych zastosowań muszą być monoklonalne. Izolacja z krwi nie wchodzi w grę, bo stężenie jednego typu monoklonalnych przeciwciał jest tam malutkie. Lepszym rozwiązaniem jest izolacja limfocytów B i selekcja względem konkretnego epitopu a następnie hodowla komórkowa. Niestety limfocyty B żyją krótko i szybko przestają się dzielić. Żeby temu zaradzić wykonuje się fuzje wyizolowanych limfocytów z komórkami szpiczaka, które jak każde komórki nowotworowe dzielą się łatwo, szybko i w nieskończoność. Taką mieszaninę komórek przesiewa się na specjalne podłoże HAT, które nie zawiera puryn. Komórki szpiczaka zostały wcześniej zmutowane w genie fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej (HGPRT), żeby zablokować jeden szlak syntezy puryn, a drugi szlak jest zablokowany przez inhibitor (aminopterynę) obecny w podłożu. Zatem pozbawione puryn - giną. Limfocyty giną, ponieważ medium nie zawiera utrzymujących jej przy życiu cytokin. Przeżywają jedynie te komórki, które mają funkcjonalny gen HGPRT i mogą robić sobie puryny, a w dodatku nie potrzebują cytokin - czyli komórki zfuzjowane. Po tej wstępnej selekcji na medium zostają oddzielne kolonie klonów komórek zfuzjowanych. Rozsiewa się na płytki wielodołkowe i selekcjonuje względem jednego epitopu. Z Tych produkujących przeciwciała na ten epitop wyprowadza się stabilną (w miarę) hodowlę, z której można następnie uzyskiwać (stosunkowo) duże ilości przeciwciał.