WYKŁAD V i VI

Klonowanie zwierząt

Narzędzia do mikromanipulacji

Większość zabiegów klonowania odbywa się przy pomocy mikromanipulatora sprzężonego z mikroskopem. Najważniejszymi narzędziami są szklane mikropipetki.

Co to jest klon?

Grupa osobników genetycznie identycznych stanowi klon.

Naturalny klon to bliźnięta jednojajowe.

Metody klonowania

• Klonowanie zarodkowe

• Klonowanie somatyczne metodą transplantacji jąder komórek somatycznych do enukleowanych oocytów.

Metody klonowania zarodków ssaków:

• Izolacja blastomerów pochodzących z zarodków 2, 4, 8 - komórkowych

• Dzieleni (bisekcja) zarodków w stadium moruli lub blastocysty

• Reagregacja blastomerów (klonowanie chimerowe)

• Transplantacja jąder komórkowych

Klonowanie zarodków metodą izolacji blastomerów

• Blastomery w początkowym okresie rozwoju zarodka są identyczne, teoretycznie z każdego z nich może powstać cały organizm.

• Tę właściwość nazywa się totipotencją.

Nie wiadomo dokładnie kiedy następuje utrata totipotencji.

Według hipotezy „inside - outside” zewnętrznie położone blastomery ulegają zmianom prowadzącym do wytworzenia trofoblastu.

Natomiast te wewnętrzne nie mające kontaktu ze środowiskiem utworzą węzeł zarodkowy.

• Usuwanie osłonki przejrzystej z zarodka (mechanicznie, enzymatycznie)

• Pipetowanie blastomerów - dezagregacja zarodka (2-4 komórki)

• Hodowla in - vitro izolowanych blastomerów

• Przeszczepianie do macicy biorczyń

Willadsen (1979r.) uzyskał identyczne bliźnięta metodą izolacji blastomerów. Rekonstruowane zarodki umieszczał w „żywym inkubatorze”.

Dzielenie (bisekcja) zarodków w stadium moruli lub blastocysty

• Podział zarodka - ważny jest kierunek podziału blastocysty.

• Hodowla in -vitro

• Przeszczepianie do biorczyń

• Należy pamiętać o tym, że zarodki muszą być doskonałej jakości, o nie budzących żadnych zastrzeżeń wyglądzie morfologicznym.

Przygotowanie do bisekcji

• Rozcięcie igłą osłonki przejrzystej

• Wyjmowanie zarodka z osłonki przejrzystej

Bisekcja zarodków - cięcie można wykonać igłą szklaną lub nożykiem wykonanym z ostrza żyletki.

Pakowanie połówki do osłonki - osłonkę przejrzystą pozyskuje się z enukleowanego oocytu lub zarodka.

Połówki w zastępczych osłonkach - większy zarodek ma lepsze szanse na utrzymanie ciąży.

Dzielenie blastocysty - ważna jest prawidłowa oś podziału blastocysty.

Bisekcja „oszczędzająca”

Nacięcie osłonki przejrzystej zarodka w stadium późnej blastocysty stymuluje wylęganie się przez powstały otwór, tworzy się ósemka; przecięcie mostka wywołuje minimalne uszkodzenia komórek.

Produkcja identycznych bliźniąt przez podział moruli/blastocysty

Metoda jest dogodniejsza, pozwala na eliminacje 2 kłopotliwych procedur tj. :

• Zatapianie w agarze

• Pośrednią biorczynię

Wykorzystywana szeroko produkcji identycznych bliźniąt u zwierząt gospodarskich, zwłaszcza: owiec, kóz, bydła.

Mankamenty:

Metoda izolacji blastomerów i bisekcji są metodami czysto laboratoryjnymi. Problemy z hodowlą izolowanych blastomerów,mała przeżywalność.

Metody te nie zmieniają zegara biologicznego - nie można ponownie izolować blastomerów lub przeprowadzać bisekcji.

Klonowanie chimerowe

Klonowanie metodą transplantacji jąder komórek zarodkowych do enukleowanych oocytów

Jest to metoda polegająca na zastąpieniu jądra komórki jajowej jądrem pochodzącym z komórek starszych zarodków (2-32).

Źródła komórek biorców:

• Dojrzałe in vivo (owulowane) oocyty pozyskiwane z jajowodów

• Oocyty osiągające dojrzałość jądrowo - cytoplazmatyczną w warunkach hodowli in vitro

• Zygoty

• Blastomery

Etapy:

1. Usunięcie jądr z komórki - biorcy (wymądrzenie; enukleacja)

• Chirurgicznie metodą McGratha i Soltera (zapewnia 90 - 100% przeżywalność komórek)

• Chemicznie - etoposid

• Fizycznie - wiązka laserowa, UV

2. Uzyskanie jądra komórki zarodkowej, które zostanie wprowadzone do wyjądrzowej komórki - biorcy - źródłem jąder są karioplasty (oocyty, blastomery
   ), izolowane blastomery (
   ) lub całe komórki (komórki węzła zarodkowego lub pierwotne komórki zarodkowe)

3. Wprowadzenie jadra komórki zarodkowej do cytoplazmy komórki biorcy

• Metoda chirurgiczna

• Niechirurgiczna - fuzja glikol polietylenowy (15 - 60 min), inaktywny wirus Sendai, prąd elektryczny

4. Aktywacja komórki biorcy - bodźce fizykochemiczne (etanol, szok termiczny, prąd elektryczny)

Klonowanie tą metodą ma wiele zalet:

• Uzyskiwanie licznych klonów (jądra pochodzące z zarodków 32 - 64 komórek)

• Seryjne klonowanie - jeszcze liczniejsze klony

• W połączeniu z oznaczanie płci zarodków - klony o pożądanej płci

Wielokrotne klonowanie zarodków ssaków metodą seryjnej transplantacji jąder komórkowych 8 blastomerowych zarodków.

Klonowanie somatyczne

Ian Wilmut (1996r.) dokonał epokowego osiągnięcia, uzyskał jagnię pochodzące z zarodka zrekonstruowanego z użyciem komórek wymienia 6 letniej owcy.

Procedura umożliwiająca uzyskanie „totipotencji”

• Komórki dawcy jąder (komórki wymienia) były przygotowywane przez redukcję koncentracji składników odżywczych w medium hodowlanym.

• Stężenie surowicy obniżono w ciągu 5 dni z 10% do 0,5%

• „głodzenie” powodowało wyjście z cyklu wzrostu i zatrzymanie ich w fazie Go

Perspektywy

Obecnie klonowanie jest nieudolną procedurą, koszty są bardzo wysokie, rzadko przeprowadzane, jednak w niezbyt odległej przeszłości to samo było powiedzieć o SU i ET.

Przewidywania

Podobnie jak SU i ET z czasem klonowanie będzie się coraz lepiej udawało i koszty znacznie się obniżą, będzie coraz powszechniej stosowane. Obecnie jest stosowane jedynie do elitarnych krów lub buhajów starszych, wyeksploatowanych i to wyjatkowo.

Możliwości wykorzystania klonowania somatycznego

• Technologie wspomaganego rozrodu wielu gatunków ssaków - klonowanie reprodukcyjne

• Klonowanie terapeutyczne

• Embriologia eksperymentalna

• Stwarza możliwość produkcji i/lub multiplikacji monogenetycznego i jednopłciowego potomstwa o wysokiej wartości hodowlanej i użytkowej

• Uzyskiwanie zwierząt transgenicznych

• Otrzymywanie transgenicznych świń, które mogą być wykorzystywane w ksenotransplantacjach

• Klonowani pupili

2005 r. pierwszy sklonowany pies Snuppy (Seoul National University Puppy) dawcy jąder - fibroblasty pobrane z ucha 3 letniego charta.

Komercyjne klonowanie psów

• Południowokoreańska firma biotechnologiczna RNL BIO

• 2008 r. sklonowanie pot bulla amerykańskiego - dawcy jąder - komórki ucha - koszt 50 tys.$

• 2009 r. - klonowanie psów z wykorzystaniem adipocytów - dwa szczeniaki rasy Beagle

---