11. CYKL KOMORKOWY

Cykl komorkowy jest podstawowym procesem w wyniku ktorego komorka matka produkuje dwie identyczne komorki corki, ktore sa rowoczesnie identyczne z komorka z ktorej powstaly. "Cykl komorkowy" jest w zasadzie zlozony z dwoch etapow, interfazy, w czasie ktorej chromosomy sa replikowane i mitozy, w czasie ktorej nastepuje podzial puli chromosomow pomniedzy komorki corki (Ryc. 11 - 1). W rzeczywistosci obok cyklu chromosomalnego istnieje rowniez cykl cytoplazmatyczny, cykl centrosomalny cykl jaderkowy i cykl aparatu Golgi'ego. Wszystkie te cykle sa wspolzalezne i zsynchronizowane.

Podzial komorkowy jest oczywiscie procesem podstawowym dla rozwoju embrionalnego ale ma rowniez zywotne znaczenie dla organizmu doroslego. Tak wiec dorosly czlowiek jest zlozony z 10 000 miliardow komorek, ktore wszystkie powstaly poprzez sukcesywne podzialy komorkowe z zaplodnionej komorki jajowej. Po osiagnieciu dojrzalosci organizmu podzialy komorkowe zachodza nadal. Codziennie powstaje miliard nowych komorek ktore zastepuja komorki tracone przez organizm. Dotyczy to szczegolnie skory, jelit i ukladu krwiotworczego. Mechanizm podzialu komorkowego jest niezwykle skomplikowany i regulowany przez wielka ilosc bialek, ktore funkcjonuja w precyzyjnie okreslonych etapach cyklu. Zdarza sie niekiedy, ze w komorce zachodzi anomalia regulacji cyklu. Taka anomalia moze sie przeniesc do komorek corek, co uwalnia je od wplywu licznych mechanizmow regulacyjnych ograniczajacych mozliwosci proliferacyjne komorek. Pojawieniu sie tych anomalii sprzyjaja produkty kancerogenne (produkty spalania tytoniu, azbest..itd.). Gdy taka anomalia utrwala sie komorka staje sie komorka rakowa. Nastepuje jej dalsza proliferacji prowadzaca do powstania nowotworu (1 mm srednicy : 1 milion komorek, 1 cm srednicy - 1 miliard komorek...). Nowotwor w wyniku "przerzutu" moze opuscic tkanke z ktorej powstal i ulec rozsianiu po calym organizmie, co powoduje dramatyczne skutki. Badania cyklu komorkowego maja wiec podstawowe znaczenie dla zrozumienia przyczyn nowotworzenia. Glownym jednak powodem, dla ktorego cykl komorkowy byl przedmiotem licznych studiow, od czasu odkrycia ponad 150 lat temu bylo to, ze jego zrozumienie przybliza nas do odpowiedzi na pytanie: co to jest zycie ?

Regulacja wewnatrzkomorkowa zostala poznana dopiero przed kilkoma dziesiatkami lat dzieki pracom prowadzonym na modelach takich jak drozdze, embriony jezowca, oocyty rozgwiazdy i plazow oraz komorki ssakow w hodowli. Uzupelniajace sie podejscia doswiadczalne a takze zbieznosc wynikow otrzymanych przy pomocy tych roznych modeli umozliwily wypracowanie ogolnego schematu wewnatrzkomorkowej kontroli podzialu komorkowego, ktory stosuje sie, z pewnymi modyfikacjami, do wszystkich eukariotow. Bylo to tym bardziej mozliwe, ze daleko idaca ewolucyjna konserwacja genow zaangazowanych w proces regulacji cyklu komorkowego pozwala na przenoszenie elementow tego ukladu z jednego gatunku do drugiego. Prace nad cyklem zostaly ukoronowane przyznaniem w 2001 roku nagrody Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny trzem badaczom. Byli nimi brytyjczycy Tim Hunt i Paul Norse oraz amerykanin Leyland Hartwell.

Cykl komorkowy jest nadal waznym tematem badan w dziedzinie biologii komorki o czym swiadcza dziesiatki artykulow na ten temat publikowanych w czasopismach naukowych kazdego roku, liczne potencjalne zastosowania wynikajace ze znajomosci jego funkcjonowania, jak rowniez zainteresowanie ta problematyka wykazywane przez przemysl farmaceutyczny.

Fazy cyklu podzialu komorkowego. Komorki, ktore nie ulagaja podzialowi znajduja sie w stanie spoczynkowym (quiescence) oznaczanym G0. Pod wplywem sygnalow mitogennych komorki takie wchodza w cykl (Ryc. 11 - 1). Klasyczny cykl komorkowy zawiera cztery fazy G1, S, G2 i M. Podczas fazy G1 ("gap" - przerwa) komorki przechodza przez punkt zwany restrykcyjnym - rodzaj bramki, po przejsciu ktorej niemozliwy jest powrot do stanu poprzedniego. Po przekroczeniu tego etapu komorka jest skazana na podzial niezaleznie od obecnosci czynnikow mitogennych. Faza G1 jest faza przygotowawcza do fasy S podczas ktorej nastepuje replikacja DNA. Faza G2 poprzedza faze M, czyli mitoze podczas ktorej nastepuje podzial chromosomow (ktorych ilosc podwoila sie podczas fazy S) pomiedzy komorki-corki. Podzial ten nastepuje w ramach wrzeciona podzialowego. Faza M sklada sie z piecu okresow : profazy (ktora konczy sie rozpadem otoczki jadrowej - NEBD - nuclear envelope brakedown), prometefazy, metafazy, anafazy i telofazy. Podzial komorkowy konczy cytokineza. Gdy komorki przestaja sie dzielic pod wplywem czynnikow antymitogennych, albo naskutek braku czynnikow mitogennych, powracaja do stanu spoczynkowego.

Fazy cyklu komorkowego odnaleziono we wszystkich typach komorek z wyjatkiem pierwszych podzialow komorkowych u embrionow drosofili i X. laevis charakteryzujacych sie szybkim nastepowaniem po sobie faz S i M. Cztery fazy podzialu komorkowego nastepuja po sobie w sposob skoordynowany tak, ze nastepna faza nie moze sie rozpoczac zanim poprzednia nie zostala poprawnie ukonczona. Liczne mechanizmy kontrolne ("checkpoints" - bramki) zapewniaja kontrole jakosci na kazdym etapie cyklu, blokujac go w razie wykrycia anomalii takich jak uszkodzony DNA lub DNA niecalkowicie zreplikowany, chromosomy niezwiazane z wrzecionem mitotycznym itp.

Kinazy zalezne od cyklin. Jednym z podstawowych odkryc w dziedzinie cyklu komorkowego byla identyfikacja rodziny kinaz bialkowych zaleznych od cyklin (CDK - cyclin-dependent kinase). Te kinazy bialkowe odgrywaja podstawowa role w inicjacji cyklu, i w kontroli gladkiego przebiegu jego poszczegolnyh faz. CDK sa aktywne wylacznie w postaci kompleksu pomiedzy podjednostka katalityczna (kinaza) i podjednostka regulacyjna (cyklina). U ssakow scharakteryzowano wiele rodzin cyklin (Cykliny A, B, C ...) jak rowniez wiele kinaz typu CDK. Kompleksy cyklin z kinazami kontroluja sukcesywne etapy cyklu komorkowego. Glowna kinaza mitotyczna kodowana u ssakow przez gen CDC2 jest nazywana CDK1. Poniewaz produkt tego genu jest bialkiem o ciezarze czasteczkowym 34 daltony (p34) u Homo sapiens, Mus musculus i Drosophila melanogaster czesto uzywa sie na jej oznaczenie symbolu p34^Cdc2. Te trzy symbole : p34^Cdc2, CDK1 i Cdc2 sa stosowane wymiennie.

U drozdzy S. cerevisiae zdefiniowano jedna kinaze typu p34^Cdc2 (produkt genu Cdc28) i szereg cyklin fazy G1 (Cln 1, 2 i 3) ktorych obecnosc jest potrzebna dla zainicjowania cyklu komorkowego i przejscia punktu START. Cykliny fazy S (Clb 5 i 6) sa niezbedne dla przejscia przez faze replikacji a cykliny fazy M (Clb 1, 2, 3 i 4) przeprowadzaja komorke przez mitoze.

Sekwencjonowanie ludzkiego genomu pozwolilo zidentyfikowac geny dla 13 kinaz i 25 cyklin. Nie znamy jeszcze wszystkich mozliwych kompleksow CDK z cyklinami. Skadinad, niektore CDK sa zaangazowane w inne procesy niz regulacja cyklu komorkowego. Na przyklad CDK5 i CDK11 posiadaja funkcje w neuronach a CDK7, CDK8 i CDK9 odgrywaja role w transkrypcji.

Jak pokazuje schemat, (Ryc. 11 - 2), CDK4 i CDK6 w kompleksie z z cyklinmi typu D reguluja przebieg fazy G1. Nastepnie paleczke przejmuje kompleks CDK2/cyklina E aby zapewnic przejscie G1/S. Kompleks CDK2/cyklina A kontroluje faze S, CDK1/cyklina A reguluje przebieg fazy G2 natomiast kompleks CDK1/cyklina B reguluje przejscie G2/M i wejscie komorki w mitoze.

Zidentyfikowane zostaly cztery poziomy regulacji aktywnosci kompleksow CDK z cyklinami.

(1) - Tworzenie kompleksow CDK/cyklina jest ograniczone w czasie przez dostepnosc cyklin, ktorych czas trwania jest zazwyczaj niewielki. Synteza, oddzialywanie z CDK i degradacja kontrolowana przez ubikwitynacje nastepuja szybko po sobie w przypadku tych bialek (Ryc 11 - 3).

Ryc. 11 - 3. Schemat oscylacji stezenia cyklin podczas cyklu komorkowego.

(2) - Modyfikacje posttranslacyjne : fosforylacja i defosforylacja (Ryc. 11 - 4) powoduja aktywacje i inaktywacje CDK. Tak wiec CDK sa fosforylowane na dwoch sasiadujacych z soba resztach aminokwasowych (Treonina-14 i Tyrozyna-15 w przypadku CDK1), ktore znajduja sie w poblizu miejsca wiazania ATP.

Ta fosforylacja inhibuje aktywnosc kinazy, ktora to inhibicja jest znoszona przez rodzine specydicznych fosfataz CDC25 A, B i C. Natomiast fosforylacja treoniny usytuowanej na "petli T" (Thr 161 w przypadku CDK1) jest niezbedna dla aktywacji kinazy. Ta fosforylacja jest katalizowana przez kompleks CDK7/cyklina H w obecnosci ko-faktora MAT1. (Ryc. 11 - 5)

(3) - Tworzenie przejsciowych kompleksow z inhibitorami bialkowymi (Ryc. 11 - 6). Istnieja dwa typy takich inhibitorow : rodzina bialek INK4, ktore uniemozliwiaja wiazanie cyklin typu D przez CDK, oraz rodzina CIP/KIP, ktorych wiazanie z kompleksem CDK/cyklina powoduje jego inaktywacje. (Ryc.11 - 6). Wystepuje tu jednak dodatkowa komplikacja, mianowicie p21^CIP1 i p27^KIP1 wiaza sie z CDK4 nie powodujac jej inhibicji. Sa one wrecz niezbedne dla utworzenia kompleksu CDK4/cyklinaD i jego przetransportowania do jadra. Bialka te natomiast inhibuja kompleks CDK2/cyklina E. Pojawienie sie p21^CIP1 i p27^KIP1 warunkuje wiec powstanie kompleksu CDK2/cyklina D rownoczesnie opozniajac aktywacje kompleksu CDK2/cyklina E. Ostatecznie CDK2/cyklina E fosforyluje p27KIP1 co prowadzi do ubikwitynacji tego bialka przez Skp1/Skp2 i do jego degradacji przez proteasom. Eliminacja p27^KIP1 jest jednym z warunkow wejscia w faze S.

(4) Zmiany lokalizacji wewnatrzkomorkowej, ktore regulowane sa z reguly rowniez przez fosforylacje i defosforylacje.

Przejscie G0/G1. Start cyklu komorkowego u drozdzy jest mozliwy gdy komorka ma odpowiednia wielkosc i gdy srodowisko jest bogate w czynniki odzywcze. W przypadku niedostatku pozywienia szybkosc syntezy cyklin fazy G1 jest nizsza od szybkosci ich proteolizy w zwiazku z czym komorka nie moze przekroczyc punktu START. U ssakow wystartowanie cyklu wymaga oprocz obecnosci czynnikow odzywczych rowniez obecnosci czynnikow wzrostowych, GF, (growth factors). Te ostatnie (np. EGF - Epidermal GF czy TGFβ - Transforming GFβ) oddzialywuja z receptorami na blonie komorkowej ktore sa kinazami tyrozynowymi niekiedy sprzezonymi z bialkami typu G. Bialka typu G, takie jak Rho czy Ras sa modyfikowane przez prenylacje (dodanie reszty o charakterze lipidowym) konca C. Prenylacja katalizowana przez transferaze farnezylowa i geranylogeranylowa sa podstawowe dla tej sciezki sygnalizacyjnej. Zaangazowana jest w ten proces kaskada kinaz bialkowych typu MAPKKK/MAPKK/MAPK takich jak Raf/MEK1/Erk1/2 czy tez PI3K/PDK1/AKT, co ilustruje Ryc. 11 - 7. Te kaskady kinaz powoduja stymulacje transkrypcji genow niezbednych dla wejscia w cykl komorkowy - takich jak cykliny D i kinaz typu CDK. Inna sciezka, ktora rowniez wazna jest dla wejscia w cykl komorkowy przechodzi przez onkogen Myc. Bialko to tworzy dimer z bialkiem Max, ktory aktywuje transkrypcje genow cykliny D i E, CDC25A, CDK4 czy E2F.

Progresja fazy G1. Poczatek cyklu komorkowego jest uwarunkowany transkrypcja pewnej liczby genow takich jak cykliny D i E, p21^CIP1 i p27^KIP1 oraz genow bedacych pod kontrola czynnikow transkrypcyjnych rodziny E2F. Czynniki te w kompleksie z bialkami z rodziny retinoblastomy : pRb, p107 i p130.Rb dzialaja jako represory natomiast po dysocjacji staja sie aktywatorami transkrypcji szeregu genow niezbednych dla progresji cyklu komorkowego (Ryc. 11 - 8, 11 - 9). Niektore mutacje w genie RB powoduja niezdolnosc bialka pRb do inaktywacji E2F, co skutkuje wymknieciem sie komorek spod kontroli i transformacja nowotworowa. Dlatego Rb w formie aktywnej, niezmutowanej, jest nazywane supresorem nowotworzenia. Dla wiazania pRb z czynnikami transkrypcyjnymi E2F niezbedne jest utworzenie kompleksu z ko-aktywatorem DP. Podczas fazy G1 CDK fosforyluja pRB, co prowadzi do dysocjacji kompleksu, uwolnienie aktywnych czynnikow E2F. CDK4 - 6/cyklina D inicjuje ten proces i pozwala na czesciowa transkrypcje. Dodatkowa fosforylacja pRB przez kompleks CDK2/cyklina E powoduje calkowita dysocjacje i osiagniecie pelnej aktywnosci przez czynniki E2F.

Rodzina E2F reguluje ekspresje genow zaangazowanych w przejscie G1/S, ale rowniez genow kodujacych bialka kontrolujace replikacje (MCM, cdc6), enzymow niezbednych dla syntezy bialka. E2F1, E2F2 i E2F3 sa silnymi aktywatorami kontrolowanymi przez pRB. E2F4 i E2F5 sa aktywatorami slabszymi kontrolowanymi przez p107 i p130. Inhibitory INK4 i CIP1/KIP utrzymujace pRB w stanie nieufosforylowanym a wiec zwiazanym z E2F sa silnymi inhibitorami cyklu komorkowego. Inaktywacja tych inhibitorow pozwala na progresje komorek w fazie G1 i na wejscie w faze S.

Inny czynnik niezbyt dobrze poznany odgrywa role w regulacji przejscia G1/S. Jest to receptor weglowodorow AhR (Aryl hydrocarbon receptor) znany rowniez jako receptor dioksyny. W obecnosci ligandu receptor ten wedruje do jadra komorkowego i staje sie aktywatorem transkrypcji wiazac sie miedzy innymi z pRB. Nie znamy funkcji tego oddzialywania , dlatego receptor AhR nazywany jest receptorem - sierota.

Koniec fazy G1 i przygotowanie przejscia G1/S. Przygotowanie do przejscia G1/S rozpoczyna sie od utworzenia kompleksu prereplikacyjnego (pre-RC) (Ryc. 11 - 10). Szesc podjednostek (Orc1 - 6) tworzy ORC (Origin Recognition Complex - kompleks rozpoznajacy poczatek replikacji), ktory to kompleks nastepnie wiaze ATP i laczy sie z DNA w regionie poczatku replikacji. ORC nastepnie rekrutuje dwa czynniki : ATPaze cdc6 i czynnik transkrypcyjny Cdt1. Ich obecnosc jest niezbedna dla przylaczenia szesciu bialek kompleksu MCM 2 - 7 (Mini Chromosome Maintenance).

Inhibicja re-replikacji podczas innych faz cyklu. Cztery mechanizmy uniemozliwiaja powtorne rozpoczecie replikacji w fazach S, G2 i M (Ryc. 11 - 11). Po pierwsze kinazy CDK fosforyluja trzy substraty : MCM, cdc6 i ORC uniemozliwiajac w ten sposob utworzenie nowych kompleksow prereplikacyjnych. Po drugie, fosforylacja cdc6 przez CDK2 inaktywuje to bialko powodujac jego degradacjie lub eksport z jadra. Po trzecie cdt1 jest inhibowane przez geminine, naturalny inhibitor replikacji, ktory pojawia sie na poczatku fasy S i, ktory pozostaje podczas S, G2 i M. I ostatecznie inhibicji replikacji sprzyja rowniez obecnosc otoczki jadrowej.

Przejscie G1/S. Caly szereg bialek i kompleksow bialkowych laczy sie z kompleksem prereplikacyjnym aby mogla sie rozpoczac synteza DNA. (Ryc. 11 - 12). Najpierw wiaze sie bialko MCM10/Dna43. Nastepnie kinaza cdc7 aktywuje kompleks prereplikatywny pod koniec fazyG1. Z kolei kompleks jest aktywowany przez kompleks CDK2/cyklina E co jest warunkiem przylaczenia cdc45 - czynnika niezbednego dla rekrutacji polimerazy . Aktywnosc CDK2 jest niezbedna dla utworzenia kompleksu cdc45 z chromatyna. Z kolei nastepuje uaktywnienie sie helikazy, utworzenie widelek replikacyjnych i polimerazy moga rozpoczac dzialanie. Topologia DNA jest kontrolowana przez kilka bialek o aktywnosci topoizomerazy.

Zgromadzenie maszynerii syntetyzujacej DNA i jej uaktywnienie jest kontrolowane przez dwie kinazy cdc7 i CDK2. Aktywnosc cdc7 zalezy od obecnosci Dbf4, bialka o krotkim okresie poltrwania, ktore jest niezbedne dla aktywnosci cdc7 tak jak cykliny sa niezbedne dla kinaz CDK. Poziom Dbf4 jest maksymalny w fazie S i jest kontrolowany z jednej strony przez synteze a z drugiej przez proteolize. Taka regulacja aktywnosci cdc7/Dbf4 powoduje, ze nazywa sie czasem to bialko DDK (Dbf4 dependent kinase) Cdc7/Dbf4 fosforyluja w zasadzie MCM a w szczegolnosci MCM2. Rekrutacja CDK2 do poczatku replikacji zachodzi przy wspoludziale ORC i cdc6. Aktywnosc CDK jest niezbedna dla replikacji DNA, ale nie znamy jeszcze wiekszosci jej substratow. Wiadomo, ze jednym z nich jest p27^KIP1 (aktywator kompleksu fazy G1 : CDK4-6/cyklina D, ktory to aktywator jest rownoczesnie inhibitorem kompleksu przejscia G1/S : CDK2/cyklina E). W wyniku fosforylacji p27^KIP1 nastepuje jego ubikwitynacja i proteoliza, co umozliwia przejscie G1/S.

Faza M - uwagi ogolne. Sklada sie z etapow zdefiniowanych na podstawie morfologii chromosomow i otoczki jadrowej juz ponad sto lat temu. I tak

- w profazie konczy sie kondensacja chromosomow i nastepuje zanik otoczki jadrowej.

• w prometafazie tworzy sie wrzeciono mitotyczne i rozpoczyna uszeregowanie chromosomow w centrum komorki

• w metafazie chromosomy ustawione sa w centrum komorki w rownym oddaleniu od biegunow wrzeciona

• w anafazie chromosomy zaczynaja sie dzelic

• w telofazie chromosomy wedruja do biegunow wrzeciona, nastepuje zanik wrzeciona, dekondensacja chromosomow i poczatek cytokinezy.

Niedawno zaproponowano nawa nomenklature opierajaca sie na znajomosci mechanizmow molekularnych, ktore kontroluja te procesy morfologiczne. Nomenklatura ta zawiera piec przejsc z ktorych kazde jest charakteryzowane przez aktywnosc odpowiedniej kinazy i proteolize pewnych substratow (Ryc. 11 - 13)

• przejscie 1 nastepuje pod koniec fazy G1 i obejmuje czesc profazy. Aktywne sa wowczas kompleks CDK1/cyklina A, Plk1 i Aurora A. W czasie tego etapu kompleks CDK1/cyklina B jest nieaktywny.

• przejscie 2 charakteryzuje sie aktywacja kompleksu CDK1/cyklina B przez CDC25 i jego translokacja do jadra, co pociaga za soba zanik otoczki jadrowej.

• przejscie 3 odpowiada prometafazie. Aby przejsc do nastepnego etapu, musi byc spelnionych szereg kryteriow z ktorych najwazniejsze to zwiazanie kinetochorow z wrzecionem mitotycznym oraz aktywacja APC/cdc20 (Anaphase Promoting Complex), w czym posredniczy wiazanie mikrotubuli z kinetochorami (patrz odpowiedni paragraf).

• przejscie 4. Podczas tej fazy wszystkie kinetochory sa zwiazane z mikrotubulami, cdc20 nie jest juz inhibowane przez MAD2 i moze calkowicie aktywowac APC. APC z kolei atakuje sekuryne prowadzac do podzialu chromosomow a takze cykline B, co prowadzi do wejscia w telofaze.

• przejscie 5 charakteryzuje sie tym, ze CDK1 przestaje byc aktywna w zwiazku z tym, ze cyklina B ulegla degradacji. Otoczka jadrowa moze wiec sie odtworzyc, nastepuje cytokineza i komorka wchodzi w interfaze. bialko cdc20 jest degradowane i zastapione przez cdh1 (lub hct1 "fizzy - related protein"), ktore to bialko wiaze sie z APC pozwalajac na degradacje niektorych innych bialek takich jak Aurora-A i Tome-1. APC/cdh1 jest obecna w komorkach az do wejscia w nastepny cykl podzialowy.

Ryc 11 - 14. Degradacja bialek w cyklu komorkowym zalezna od APC. APC^cdc20 jest najpierw aktywowane w prometafazie gdzie indukuje degradaccje cykliny A i kinazy Nek2 (odgrywajacej role w struktirze centrosomu). Ten kompleks jest odpowiedzialny rowniez za degradacje cykliny B, kinezyny Xkid, ktora przenosi chromosomy w strone rownika komorki i sekuryny. W anafazie powoduje degradacje kinezyn Kip1 i Cin8, ktore transportuja bieguny wrzeciona w przeciwlegle regiony komorki, lecz pozniej sa w wiekszosci degradowane. Poczawszy od poznej anafazy az do wyjscia z fazy G1 degradacja wszystkich bialek jest zalezna od APC^Cdh1. Kompleks ten indukuje proteolize Cdc20, Prc1, Tome-1, Plk1 i Aurora. Tome-1 (Trigger of mitotic entry) jest kinaza, ktora naznacza do degradacji kinaze Wee1. Wee1 inhibuje Cdk1 i jego degradacja jest niezbedna do wejscia w mitoze. Degradacja Tome-1 poczas fazy G1 powoduje akumulacje Wee1 podczas interfazy uniemozliwiajac przedwczesna aktywacje kompleksu cykliny B z Cdk1. Aurora-A jest kinaza odgrywajaca role w syntezie centrosomu. Jej nadekspresja powoduje tetraploidyzacje. APC^Cdh1 powoduje tez degradacje Orc1 Cdc6 i Geminin we wczesnej fazie G1. Bialka te biora udzial w tworzeniu ORC (Origin Recognition Complex), lecz nie pozwalaja na replikacje. Dopiero ich degradacje umozliwia start syntezy DNA.

Przejscie G2/M i profaza/metafaza. (Ryc. 11 - 15). Faza G2 jest czesto przedstawiana jako faza przyhotowawcza do mitozy, ale ten termin maskuje nasza niewiedze w tej materii. G2 odznacza sie tym, ze nastepuje w niej poczatek kondensacji chromosomow. Kompleks CDK1/cyklina A jest aktywna w G2, ale jej funkcje sa nieznane. Przejscie profaza/metafaza nieslusznie czasami nazywane G2/M jest kontrolowane przez kompleks CDK1/cyklina B. Na przejsciu G2/poczatek profazy CDK1 znajduje sie w postaci nieaktywnego monomeru. Pozniej, w miare syntezy cykliny B, kompleks CDK1/cyklina B ulaga nagromadzeniu osiagajac swoj maksymalny poziom w profazie. W tym stadium kompleks jest jeszcze nieaktywny poniewaz dwie reszty Thr-14 i Tyr-15 sa fosforylowane przez kinazy Wee1 i Myt1. Natomiast THR-161, ktorej fosforylacja jest niezbedna dla aktywnosci kinazy CDK1 jest juz fosforylowana przez kompleks CDK7/cyklina H/Mat1. Cztery mechanizmy sa odpowiedzialne za aktywacje kompleksu CDK1/cyklina B w momencie gdy komorka jest juz gotowa aby wejsc w faze M. (Ryc. 13).

-po pierwsze, kinazy inhibujace kompleks Wee1 i Myt1 sa inaktywowane przez fosforylacje przez kinazy PKB/AKT i p90^RSK a TOME1 ("Trigger of Mitotic Entry" - wyzwalacz wejscia w mitoze) wspolnie z Skp1 inicjuje ubikwitynacje i szybka degradacje proteolityczna Wee1 pod koniec fazy G2.

-po drugie, dwie reszty Thr-14 i Tyr-15, inhibyjace aktywnosc kinazy w stanie ufosforylowanym sa defosforylowane przez fosfatazy CDC25. Funkcje kazdej z trzech fosfataz CDC25 nie sa jeszcze do konca wyjasnione. Wydaje sie, ze CDC25B rozpoczyna aktywacje CDK1/cyklina B. CDC25C jest nastepnie aktywowana przez CDK1/cyklinaB co w wyniku powodowaloby autoamplifikacje systemu (sprzezenie zwrotne dodatnie), oraz przez PLK1. CDC25A jest stabilizowana przez CDK1/cyklina B.

-po trzecie, cyklina B jest fosforylowana przez rozmaite kinazy, co jest niezbedne dla oddzialywania pomiedzy CDC25 i CDK1, a wiec dla aktywnosci kinazy.

-po czwarte, wreszcie, kompleks CDK1/cyklina B migruje da jadra, gdzie znajduje sie wiekszosc jego substratow, takich jak laminy, nukleolina i kondensyna. Oddzialywania cykliny B1 z cyklina F i z importyna  reguluja lokalizacje w jadrze kompleksu CDK1/cyklina B.

Kondensacja chromosomow. Jest to jeden z pierwszych etapow morfologicznych podzialu komorkowego. Regulacja tego procesu zachodzi z udzialem kondensyny, kompleksu zlozonego z pieciu podjednostek hCAP-C, hCAP-E, h-CAP-D2, hCAP-G i hCAP-H. Sa one silnie konserwatywne z ewolucyjnego punktu widzenia i znajduje sie je u wszystkich eukariotow. Kondensyna katalizuje jedna reakcje : superspiralizacje czasteczki DNA zalezna od ATP. Aktywnosc kompleksu CDK1/cyklina B jest niezbedna dla funkcji kondensyny podobnie jak jej sumoilacja post-translacyjna (sumo : "small ubiquidin - related modifier" - niskoczasteczkowy modyfikator ubikwitynopodobny). Oddzialywanie topoizomerazy II z CDK1 wydaje sie rowniez byc istotne dla kondensacji chromosomow katalitycznaj aczkolwiek w tym przypadku aktywnosc kinazy CDK1 nie jest niezbedna. Fosforylacja histonu H3 (oraz CENP-A w przypadku centromeru) przez kinaze Aurora-B jest rowniez bezposrednio zaangazowane w kondensacje chromosomow. Po zakonczeniu telofazy tuz przed widoczna dekondensacja chromosomow nastepuje defosforylacja histonu H3.

Separacja chromatyd i przejscie metafaza/anafaza. Po replikacji DNA dwie homologiczne kopie genomu, chromatydy, pozostaja polaczone dzieki kompleksowi bialkowemu znanemu pod nazwa kohezyny (Ryc. 11 - 17). W metafazie kohezyna jest fosforylowana przez Plk1 naskutek czego staje sie ona wrazliwa na degradacje proteolityczna. Na poczatku anafazy kohezyna jest trawiona przez specyficzna kaspaze : separaze (ktora rowniez jest fosforylowana) co pozwala na rozejscie sie chromatyd. Przesuwaja sie one w kierunku biegunow wrzeciona mitotycznego. Separaza podczas cyklu podzialowego tworzy kompleks z innym bialkiem, sekuryna. Aktywacja separazy nastepuje w wyniku ligacji ubikwityny przez kompleks APC (Anaphase Promoting Complex) aktywowany przez bialko cdc20. Tak wiec APC/cdc20 ubikwitynuje sekuryne powodujac jej degradacje przez proteasom. Wowczas uwolnione zostaje separaza, ktora trawi kohezyne. Aby ten proces mogl zajsc niezbedny jest szereg fosforylacji. Tak wiec fosforylacja kohezyny (podjednostki Scc1) przez kinaze Plk1 czyni ja szczegolnie podatna na dzialanie separazy. Fosforylacja APC przez kompleks CDK1/cyklina B jest niezbedna dla aktywnosci tego kompleksu. Rowniez separaza, aby stac sie aktywna musi byc fosforylowana przez kompleks CDK1/cyklina B. Ubikwitynacja sekuryny za pomoca komleksu APC/cdc20 prowadzi do jej destrukcji, ale nie jest to jedyny substrat tego kompleksu. Jest on rowniez odpowiedzialny za destrukcje cykliny B, co ma szereg konsekwencji fizjologicznych spowodowanych spadkiem aktywnosci CDK1. Nalezy do nich zanik wrzeciona podzialowego, inicjacja cytokinezy i przejscie do fazy G1. Trawienie cykliny B w anafazie jest wystarczajace dla odtworzenia warunkow niezbednych dla transkrypcji r-DNA (w jaderku), ktora nie mogla zachodzic w fazie M.

Ryc 11 - 17. Mechanizm inicjujacy segregacje chromosomow.

Kontrola przyczepu chromatyd do miktotubuli. W komorkach istnieje system kontroli zwany bramka mitotyczna (mitotic checkpoint) pozwalajacy na sprawdzenie stanu przyczepienia chromosomow do biegunow wrzeciona. (Ryc. 11 - 18) Bramka nie pozwala na segregacje chromosomow nawet jesli tylko jeden z nich nie jest przyczepiony do obydwu biegunow. Kluczowym elementem bramki jest Mad2. Jest to bialko, ktore w stanie ufosforylowanym blokuje podjednostka adaptatorowa APC cdc20. Fosforylacja Mad2 jest warunkowana brakiem napiecia mechanicznego w kinetochorach. Sadzi sie, ze napiecie, ktore pojawia sie w kinetochorach gdy sa one przyczepione do obydwu biegunow wrzeciona powoduje inaktywacje kinazy fosforylujacej Mad2. Bramka zostaje otwarta gdy wszystkie chromosomy znajda sie pod wplywem sil rozciagajacych. Wowczas kinaza centromerowa ulega inaktywacji i przestaje fosforylowac Mad2. W tej sytuacji rownowaga przesuwa sie na korzysc defosforylacji przez fosfataze obecna w srodowisku. W wyniku tej defosforylacji Mad2 przestaje byc inhibitorem czynnika Cdc20, ktory aktywuje APC i komorka wchodzi w anafaze.

Kontrola orientacji wrzeciona i przejscia anafaza/telofaza. Wejscie cyklu komorkowego w telofaze zalezy od grupy bialek (mitotic exit network), ktore pozwalaja na uwolnienie i aktywacje fosfatazy Cdc14 (bialka zlokalizowanego w jaderku w okresie interfazy) Fosfataza ta defosforyluje i aktywuje cdh1 stanowiac przeciwwage dla dla fosforylacji i inaktywacji tego bialka przez kompleks CDK1/cyklinaB. Cdh1 oddzialywuje w tych warunkach z APC. Aktywny kompleks APC/cdh1 powoduje degradacje cykliny B, Tome-1, Aurory-A i cdc20 umozliwiajac wejscie w telofaze i dokonczanie mitozy.

Dodatkowy system kontroli (bramka orientacji wrzeciona) poznany zostal u drozdzy. Pozwala on na sprawdzenie usytuowania wrzeciona w komorce. Jesli nie jest ono poprawnie usytuowane bramka jest zamknieta w wyniku czago fosfataza cdc14 jest nieaktywna i bialko cdh1 pozostaje fosforylowane. Komorka jest blokowana w anafazie.

Cytokineza. Jest to etap koncowy podzialu, ktory prowadzi do indywidualizacji dwoch komorek - corek. Glownym elementem strukturalnym aktywnym na tym etapie jest pierscien kurczliwy zawierajacy aktyne miozyne i inne bialka. Pierscien kurczy sie na poziomie rownika komorki w strefie gestej, gdzie zbiegaja sie mikrotubule wybiegajace z dwoch przeciwnych biegunow wrzeciona. Ostatecznie pierscien zamyka sie rozdzielajac dwie komorki - corki. Motorem pierscienia jest miozyna. Pomiedzy bialkami znajdowanymi w tej strefie zidentyfikowano m.in. septyny, bialka z domena FCH (Fes/Cip4 Homology - domena oddzialywujaca z tubulina). Cytokineza jest niemozliwa jesli chromosomy nie sa rozdzielone symetrycznie pomiedzy komorki-corki. W kontroli tej konfiguracji biora udzial trzy rodzaje kinaz : kinazy CDK, kinaza Plk1 i kinaza zwana "citron". Inaktywacja kinazy CDK1 jest niezbedna dla inicjacji cytokinezy poniewaz CDK1 inhibuje miozyne fosforylujac lekki lancuch tego bialka. Plk1 mialaby swoj udzial w inicjacji cytokinezy inicjujac degradacje cykliny B. Mechanizm dzialania kinazy "citron" jest nieznany. Niektore bialka migruja od centromerow do strefy posredniej (midzone). Nazywane sa one bialkami pasazerowymi. Nalezy do nich INCENP (inner centromeric protein - wewnetrzne bialko centromerowe), kinazy Plk1 i Aurora B. Sa one niezbedne dla cytokinezy, ale ich rola nie jest wyjasniona.

Cykl centrosomalny. Centrosomy sa organellami organizujacymi mikrotubule i zapewniajacymi utworzenie wrzeciona mitotycznego. Odgrywaja rowniez role w przejsciu G1/S. Centrosom jest struktura skomplikowana utworzona z dwoch usytuowanych prostopadle centrioli oraz z "materialu pericentrosomowego".

Rownoczesnie z replikacja DNA komorka przed kazdym podzialem komorkowym musi zadbac o replikacje swojego centrosomu. Ma to miejsce w fazie S. Podobnie jak DNA, centrosomy rowniez ulegaja segregacji pomiedzy komorki corki podczas wychodzenia z mitozy. Ten cykl centrosomalny jest dobrze opisany pod wzgledem morfologicznym, ale niewiele mozna o nim powiedziec na poziomie molekularnym.

Replikacja centrosomu przechodzi przez okreslone fazy : duplikacji, elongacji, dojrzewania, rozdzialu i segregacji (Ryc. 11 - 20). W regulacji tego cyklu biora udzial kinazy CDK2/cyklina A - E. CDK fosforyluja bialko nukleofozmine, co inicjuje dysocjacje centrosomow. Rowniez kinaza Plk1 zostala zlokalizowana w centrosomach. Aktywuje ona CDK1/cykline B, ktorey to kompleks fosforyluje i aktywuje kinezyne Eg5 bioraca udzial w segregacji centrosomow. Zidentyfikowano jeszcze szereg innych kinaz w centrosomach, ale ich rola jest niejasna. W cyklu centrosomalnym istotna role odgrywa obok fosforylacji przez kinazy rowniez proteolityczna degracja bialek zalezna od ubikwityny.

Ryc 11 - 20. Cykl centrosomalny.

Cykl komorkowy jako cykl degradacji proteolitycznej. Cykl komorkowy moze byc uwazany jako scisle koordynowany cykl syntez, aktywacji i proteolitycznej destrukcji bialek bioracych w nim udzial. Specyficzna degradacja jest dokonywana przez proteasom, ktory jest molekularnym kompleksem co najmniej 44 podjednostek bialkowych. Aby byc substratem dla tego kompleksu bialko przeznaczone do degradacji powinno zostac przedtem ubikwitynowane. Ta modyfikacja polega na kowalentnym przylaczeniu kilku czasteczek ubikwityny do lancucha bocznego niektorych lizyn w bialku przeznaczonym do degradacji. Ubikwityda jest to peptyd sygnalowy o ciezarze czasteczkowym 8 kDa. Proces ubikwitynacji dokonywany jest przez kaskade enzymow (E1 - aktywator ubikwityny, E2 koniugator ubikwityny i E3 ligaza ubikwityny, Ryc. 11 - 21). W sterowanie cyklem komorkowym zaangazowane sa dwa typy ligaz E3. Pierwsza z nich to kompleks SCF -(Skp1 - cullin-F-box) , ktory aktywowany jest przez bialko Skp1 zawierajace kasete "F-box". Druga ligaza nazywa sie APC (Anaphase Promoting Complex) lub cyklosom. Jest ona aktywowana przez jedno z dwoch bialek aktywatorowych cdc20 lub cdh1. Aktywatory zmieniala nieco specyficznosc APC. APC/cyklosom jest aktywny poczawszy od konca fazy G2 do polowy fazy G1. Kompleks SCF natomiast jest aktywny od polowy fazy G1 do poczatku fazy G2. Podstawowe substraty, ktore te kompleksy ubikwitynuja sa wyszczegolnione na Ryc. 10 - 22. Degradacja tych substratow jest niezbedna dla postepu cyklu. I tak np. degradacja kinazy Wee1 za posrednictwem Tome-1 umozliwia aktywacje CDK1/cyklina B. Pozniej degradacja Tome-1 na koncu fazy M pozwala na ponowne pojawienie sie Wee1 a wiec i na gromadzenie sie nieaktywnej CDK2 w fazie G1. Podczas przejscia metafaza/anafaza wazne jest zdegradowanie cykliny B, co powoduje na inaktywacje CDK1 i na postep cyklu podzialowego po przekroczeniu metafazy.

Ryc. 11 - 21. Naznaczanie bialka "Target" przeznaczonego do proteolizy przez proteasom 26S. Ubikwityna jest aktywowana przez enzym E1 z utworzeniem tioestru w procesie zaleznym od ATP. Drugim etapem jest przeniesienie ubikwityny na cysteine przez enzym E2. W koncowym etapie enzym E3 (ktorym moze byc kompleks APC lub SCF) przenosi reszte ubikwityny na reszte lizyny w odpowiednim substracie. Kompleksy APC i SCF sa odpowiedzialne za specyficznosc tej ostatniej reakcji.

Ryc. 11 - 22 Cykl komorkowy, jako cykl degradacji proteolitycznej

Elementy kontrolne cyklu komórkowego (podsumowanie).

Ryc. 11-23 - Aktywność CDK w kolejnych etapach cyklu

Ryc. 11-24 zewnętrzne elementy kontrolne cyklu komórkowego.

Aktywność podstawowych regulatorów cyklu komórkowego jest z kolei regulowana przez liczne dodatkowe regulatory, co sprawia, że kinazy zależne od cyklin i kompleks APC (Anaphase Promoting Complex) są szybko, w odpowiedniej kolejności i z dużą niezawodnością aktywowane w odpowiednich stadiach cyklu. Kompleksy cyklin z CDK są kontrolowane przez fosforylację w takich pozycjach łańcucha polipeptydowego podjednostki CDK, że powoduje to inhibicje ich katalitycznej aktywności, ale również przez inhibitory cyklin (CKI - Cyclin Kinase Inhibitor), transkrypcyjną kontrolę cyklin oraz przez regulatory oraz przez ubikwitynozależną proteolizę cyklin i CDI. Aktywność APC jest dostrajana przez białkowe inhibitory, które powodują to, że jest on nieaktywny poza okresem mitozy.

Kompleks SCF - ligaza ubikwityny kontrolująca ubikwitynozależną proteolizę poza okresem mitozy również ma wkład w tę regulację wyzwalając w odpowiednim momencie ubkwitynację i proteolizę niektórych CDI i cyklin przejścia G1/S. Rdzeń kompleksu SCF (Skp1 - F box - Cullin, w którym decydująca o specyficzności podjednostka zawierająca kasetę zwaną F-box jest wymienna) rekrutuje i ubikwitynuje liczne białka, które zazwyczaj są uprzednio fosforylowane przez CDK lub przez inne kinazy, co jest warunkiem ich rospoznania przez białka typu F-box.

Kontrola cyklu może być podsumowana w skrócie następująco: W odpowiedzi na odpowiedni sygnał zewnętrzny (lub odpowiednią wielkość komórki) G1-CDK wyzwala wejście komórki w G1/S czemu towarzyszy synteza cyklin G1/S i S i innych składników niezbędnych w fazie S. Aktywacja G1/S-CDK i S-CDK inicjują duplikację chromosomów i duplikację centrosomów. Poziom cyklin M wzrasta w czasie fazy S oraz po jej zakończeniu, ale są one kontrolowane przez fosforylację katalizowaną przez Wee1, co inhibuje ich aktywność. Defosforylacja CDK przez fosfatazy z grupy CDC25 wyzwala funkcjonowanie M-CDK powodując utworzenie wrzeciona mitotycznego i inne procesy związane z przygotowaniem segregacji chromosomów. Kiedy chromosomy zgromadzą się w płaszczyźnie równiowej komórki aktywacja APC^CDC20 inicjuje separację chromatyd siostrzanych równocześnie inaktywując CDK, co prowadzi do defosforylacji substratów CDK i do dokończenia mitozy i cytokinezy. Zmniejszająca się aktywność CDK pociąga z a sobą aktywację APC^CDH1 a w wyniku zmniejszenie się poziomu cyklin do momentu w którym ten kompleks jest inaktywowany przez CDK na początku nowego cyklu komórkowego.Liczne dodatkowe regulatory współpracują z tymi wyżej wymienionymi. Należą do nich kinazy Plk1, Aurora A i Aurora B. Plk1 stymuluje postęp cyklu aktywując Cdc25 i inhibując inhibitor APC Emi1. Postęp mitozy zależy również od systemu zwanego bramką wrzeciona podziałowego, który to system inhibuje APC^Cdc20 do momentu, aż wszystkie chromosomy będą odpowiednio przyczepione do obydwóch biegunów wrzeciona (centrosomów). Składnikami tego systemu są kinazy Mad2 i Mad3 wiążące i inhibujące Cdc20. W momencie gdy wszystkie są na swoich miejscach Cdc20 zostaje uwolnione i może z kolei aktywować APC inicjując segregację chromosomów.

Cykl komorkowy

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

163

Ryc 11 - 1. Etapy cyklu komorkowego.

Ryc 11 - 2. Rola cyklin i kinaz cyklinozaleznych w cyklu komorkowym

Ryc.11 - 4 Tworzenie sie i rozpad aktywnego kompleksu MPF w cyklu komorkowym.

Ryc. 11 - 5. Aktywatory i inhibitory kinaz w cyklu komorkowym

Ryc. 11 - 6. Tworzenie kompleksow bialkami przez kompleksy CDK z cyklinami

Ryc. 11 - 7. Bialka typu G i kaskady kinaz biorace udzial w inicjacji wejscia komorek w cykl podzialowy.

Ryc 11 - 10. Tworzenie kompleksu prereplikacyjnego

Ryc. 11 - 9. Inicjacja wejscia w cykl komorkowy przez fosforylacja pRB.

Ryc. 11 - 11. Mechanizmy blokujace powtorna replikacje w tym samym cyklu komorkowym.

Ryc. 11 - 12. Wejscie komorek w faze S

Ryc. 11 - 13. Etapy fazy M cyklu komorkowego - dwa systemy klasyfikacji.

Ryc. 11 - 15. Przejscie G2/M

Ryc. 11 - 16. Kondensacja chromosomow

Ryc. 11 - 18. Bramka mitotyczna

Ryc 11 - 19. Kontrola orientacji wrzeciona i wyjscia z mitozy

Ryc 11 - 8. Mechanizm funkcjonowania supresora nowotworzenia (antyonkogenu), bialka Rb

---