Wydział: BiNoŻ

Kierunek: Biotechnologia
semestr: IV

gr. dziekańska: 3

LABORATORIUM Z BIOCHEMII

OKSYDOREDUKTAZY

Data wykonania ćwiczenia: 06.05.2010

Data oddania sprawozdania: 17.05.2010 Maja Szczepaniak

Tomasz Styś Marcin Szustak

WSTĘP TEORETYCZNY

Oksydoreduktazy są to enzymy odznaczające się wysoką specyficznością. Katalizują one reakcje utleniania i redukcji (redox), czyli odwracalne przemiany związane z przeniesieniem protonów i elektronów. Mają one złożoną budowę. Biorąc pod uwagę sposób działania, oksydoreduktazy zostały podzielone na dwie grupy:

• dehydrogenazy oraz reduktazy (są to nazwy potoczne) - stanowią grupę enzymów katalizujących przenoszenie atomów wodoru, bądź elektronów z jednych związków na inne. Nie przenoszą one tlenu. Katalizowane przez nie reakcje mogą być sprzężone z mitochondrialnym łańcuchem oddechowym i dostarczają wówczas energii chemicznej.

• oksydazy, oksygenazy oraz hydroksylazy (podobnie jak wyżej są to nazwy potoczne) - stanowią grupę enzymów katalizujących reakcje utleniania i redukcji, w których uczestniczy tlen, niejednokrotnie połączony z różnymi związkami.

Działanie dehydrogenaz zaliczanych do klasy oksydoreduktaz sprowadza się do utleniania substratu, poprzez odłączenie od niego dwóch atomów wodoru i przeniesieniu ich na różnego rodzaju przenośniki. Wyróżnia się:

• dehydrogenazy współpracujące z NAD albo z NADP - ich zadaniem jest dostarczenie zredukowanego NADH₂ do mitochondrialnego łańcucha oddechowego,

• dehydrogenazy współdziałające z flawinami (tzw. flawoproteiny)

• dehydrogenazy związane z kwasem liponowym.

Wszystkie dehydrogenazy cechuje bardzo wysoka specyficzność substratowa.

Działanie oksydaz sprowadza się do przeniesienia atomów wodoru (proton plus elektron) z substratu na cząsteczkę tlenu, w wyniku czego powstaje cząsteczka wody, bądź nadtlenku wodoru. Oksydazy mają zróżnicowaną budowę. Są wśród nich miedzioproteiny, flawoproteiny oraz hemoproteiny. Substratami w reakcjach katalizowanych przez oksydazy są zróżnicowane pod względem budowy związki chemiczne. Mogą mini być np.: alkohole, monosacharydy, aldehydy, AA, fenole, aminy, steroidy, związki nitrowe i wiele innych. Do grupy oksydaz zalicza się między innymi: oksydazę cytochromową, oksydazę ksantynową (biorącą udział w reakcji prowadzącej do powstania kwasu moczowego), oksydazę aminokwasową (katalizującą reakcję dezaminacji AA połączoną z utlenianiem), oksydazę fenolową (katalizującą reakcje, w których powstają związki chinonowe, odpowiadające za ciemnienie owoców), czy oksygenazę askorbinianową (przeprowadzającą reakcję utleniania witaminy C do formy nieaktywnej).

źródło:

• „Biochemia” Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer

• www.wikipedia.pl

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

2.1. Przygotowanie ekstraktu enzymatycznego:

Analizowany surowiec (chrzan) umyliśmy, oddzieliliśmy części niejadalne, obraliśmy i rozdrobniliśmy. Naważkę 10g przygotowanego wstępnie produktu roztarliśmy w moździerzu z dodatkiem 1g CaCO₃ do uzyskania jednorodnej masy. Próbę przenieśliśmy ilościowo do cylindra o pojemności 200 ml i uzupełniliśmy wodą destyowaną do kreski. Po 15 min przesączyliśmy.

2.2. Analiza jakościowa ekstraktu enzymatycznego:

Celem ćwiczenia jest stwierdzenie obecności w analizowanym surowcu trzech enzymów oksydoredukcyjnych: oksydazy o – difenolowej (PPO), peroksydazy (POD) i katalazy (CAT). Doświadczenie polegało na zmieszaniu ekstraktów z odpowiednimi substratami. Obserwowane efekty zachodzących reakcji wykażą obecność danego enzymu.

2.2.2. Wykonanie oznaczenia:

W sześciu probówkach umieściliśmy po 2ml ekstraktu enzymatycznego otrzymanego wg p. 2.1 i do każdej probówki dodaliśmy po 3 ml wody destylowanej, natomiast w probówkach 7 i 8 umieściliśmy po 5 ml wody destylowanej.

Próba odniesienia (probówka 1)

Oksydaza o- difenolowa (probówki 2 i 3); do probówki 2 dodaliśmy 10 kropli 1% katecholu, do probówki 3 dodaliśmy 10 kropli 1% pirogalolu.

Peroksydaza (probówka 4 i 5); do probówki 4 dodaliśmy 10 kropliu 1% katecholu i 10 kropli 1% H₂O₂, do probówki 5 dodaliśmy 10 kropli 1% pirogalolu i 10 kropli 1% H₂O₂.

Katalaza (probówka 6); do probówki 6 dodaliśmy 10 kropli 1% H₂O₂.

Próby odczynnikowe (probówka 7 i 8); do probówki 7 dodaliśmy 10 kropli 1% katecholu 1%, do probówki 8 dodaliśmy 10 kropli 1% pirogalolu.

Wszystkie probówki wymieszaliśmy.

Wyniki obserwacji został zestawione w tabeli:

Nr	Próba	Oznaczany enzym	Wynik analizy	Opis próby
1	Ekstrakt	Próba odniesienia		Brak jakiejkolwiek barwy
2	Ekstrakt + katechol	Oksydaza o – difenolowa	+/-	Bladobeżowe lekkie zabarwienie
3	Ekstrakt + pirogalol	Oksydaza o – difenolowa	+/-	Lekkie bladożółte zabarwienie
4	Ekstrakt + katechol + H2O2	Peroksydaza	+++	Intensywne brunatno-czerwone zabarwienie
5	Ekstrakt + pirogalol + H2O2	Peroksydaza	+++	Intensywne brunatno-czerwone zabarwienie
6	Ekstrakt + H2O2	Katalaza	-	Brak wydzielających się pęcherzyków
7	Woda + katechol	Próby odczynnikowe		Brak barwy
8	Woda + pirogalol	Próby odczynnikowe		Brak barwy

Wnioski:

Jak widać z tabeli w chrzanie nie ma katalazy o czym świadczy nie wydzielanie się gazu w probówce 6. Enzym ten katalizuje rozkład nadtlenku wodoru. Delikatne zabarwienie w probówkach 2 i 3 świadczy o minimalnej obecności oksydazy o-difenylowej (enzymu który przede wszystkim działa na o – difenole, utleniając je do o – chinonów, które ulegając dalszym przemianom zamieniają się w melaniny dające brunatne zabarwienie), natomiast intensywne brunatno-czerwone zabarwienie w probówkach 4 i 5 ukazuje obecność dużej ilości peroksydazy.

Wyniki analizy jakościowej dla wszystkich surowców badanych na pracowni zestawione w tabeli:

Surowiec	Katalaza	Oksydaza o-difenylowa	Peroksydaza
Ziemniak	++	+++	++
Chrzan	+/-	+/-	+++
Kapusta włoska	++	-	++
Rzodkiewka	++	+/-	++
Kapusta pekińska	+	-	+

Wnioski:

Z tabeli wynika, że katalazę w umiarkowanych ilościach zawierają: ziemniak, kapusta włoska i rzodkiewka. W duże ilości oksydazy o-difenylowej zaopatrzony jest ziemniak, a najwięcej peroksydazy z badanych surowców zawiera chrzan.

2.3. Analiza ilościowa:

Celem doświadczenia jest określenie i porównanie poziomu katalazy i peroksydazy w analizowanych surowcach.

2.3.1. Oznaczanie aktywności katalazy:

Zasada oznaczania aktywności katalazy(CAT) polega na odmiareczkowaniu za pomocą KMnO₄ w środowisku H₂SO₄ nie rozłożonego przez katalazę H₂O₂.

2KMnO₄ + 5H₂O₂ + 4H₂SO₄ -> 2KHSO₄ + 2MnSO₄ + 8H₂O + 5O₂

Jednostką aktywności (1U) katalazy jest µmol H₂O₂ rozłożony w ciągu 1 minuty (U –unit, jednostka aktywności enzymu) w 20°C.

Aktywność katalazy w produkcie podaje się w jednostkach aktywności enzymu zawartego w 1g produktu [U/g]

2.3.1.2. Wykonanie oznaczenia:

W dwóch kolbach stożkowych o pojemności 200 ml umieściliśmy po 10 ml ekstraktu enzymatycznego otrzymanego wg punktu 2.1 i po 20 ml wody destylowanej. Do jednej z kolb, służącej do przygotowania próby odniesienia, dodaliśmy 3cm³ 1% H₂O₂. Reakcję rozkładu nadtlenku wodoru za pomocą katalazy prowadziliśmy dokładnie 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie do tej samej kolby dodaliśmy po 5 ml H₂SO₄ w celu inaktywowania enzymów i przerwanie reakcji enzymatycznych. Do drugiej kolby, służącej do przygotowania próby odniesienia, dodaliśmy najpierw 5cm³ 10% H₂SO_4, celem inaktywacji enzymów a następnie 3cm³ 1% H₂O_2. Obie próby miareczkowaliśmy 0,1 M KMnO₄ do słabo różowej barwy nie znikającej co najmniej przez 15 sekund.

Wyniki miareczkowania i obliczenia:

Objętość nadmanganianu zużyta na zmiareczkowanie próby kontrolnej: a = 31,4 cm³

Objętość nadmanganianu zużyta na zmiareczkowanie próby właściwej: b = 30,2 cm³

Aktywność katalozy w analizowanym produkcie obliczamy ze wzoru:

$$CAT = \frac{(a - b) \bullet V_{\text{ekstr}} \bullet c}{V_{\text{enz}} \bullet m_{\text{prod}} \bullet t}$$

gdzie,

a - objetość nadmanganianu zużyta do zmiareczkowania próby kontrolnej [cm³],
b - objętość nadmanganianu zużyta na zmiareczkowanie próby właściwej [cm³],
V_ekstr – całkowita objętość ekstraktu enzymatycznego [200 cm³],
V_enz – objętość ekstraktu enzymatycznego pobrana do oznaczenia [10 cm³],
c - miano KMnO₄, równe 250, gdyż 1 cm³ 0,1 KMnO₄ odpowiada 250 µmoli H₂O₂,
t - czas reakcji [30 min.],
m_prod - naważka produktu [10 g], z której uzyskano 200 cm³ ekstraktu.

$$CAT = \frac{(31,4 - 30,2) \bullet 200 \bullet 250}{10 \bullet 10 \bullet 30} = 20\ \lbrack\frac{U}{g}\rbrack$$

2.3.2. Oznaczanie aktywności peroksydazy:

Zasada oznaczenia aktywności peroksydazy(POD) polega na spektrofotometrycznym oznaczeniu barwnych produktów utleniania gwajakolu (substrat aromatyczny) przez nadtlenek wodoru w obecności peroksydazy. Oznaczenie polega na pomiarze przyrostu absorbancji mieszaniny reakcyjnej w czasie 1 min.

Jednostką aktywności ( 1U ) peroksydazy jest przyrost absorbancji o 0,1 w czasie jednej minuty w warunkach prowadzenia oznaczenia.

2.3.2.2. Wykonanie oznaczenia:

Do dwóch probówek dodaliśmy bufor fosforanowy, roztwór gwajakolu oraz ekstrakt enzymatyczny. Pierwsza z probówek to próba kontrolna, druga to próba właściwa, do której przed samym pomiarem kalorymetrycznym dodaliśmy kilka kropel H₂O_2. Następnie zmierzyliśmy absorbancję próby właściwej wobec próby kontrolnej w czasie zerowym i po 1 minucie.

Wyniki pomiaru absorbancji i obliczenia:

Absorbancja próby właściwej po czasie zero równa była: A₀ = 0,267

Absorbancja próby właściwej po czasie 1 minuty: A_1min = 0,613

Aktywność peroksydazy w analizowanym produkcie obliczyliśmy z wzoru:

$$POD = \frac{A \bullet V_{\text{ekstr}}}{0,1 \bullet V_{\text{enz}} \bullet m_{\text{prod}}}$$

gdzie,  

- przyrost absorbancji w czasie 1 minuty, (A_1min - A₀ = 0,346),
V_ekst - całkowita objętość ekstraktu enzymatycznego [200 cm³],
0,1 – współczynnik przeliczeniowy jednostki aktywności,
V_enz – objętość ekstraktu enzymatycznego pobrana do oznaczenia [1 cm³],
m_prod – naważka produktu [10 g], z której otrzymano 200 cm³ ekstraktu.

$$POD = \frac{0,346 \bullet 200}{0,1 \bullet 1 \bullet 10} = 69,2\ \frac{U}{g}$$

2.4. Wyniki analizy ilościowej:

Wyniki analizy ilościowej oznaczania aktywności katalazy i peroksydazy w analizowanych surowcach zestawione w tabeli:

Lp.	Surowiec	Aktywność enzymatyczna [U/g]
		Katalaza
1	Ziemniak	148,2
2	Chrzan	20
3	Kapusta włoska	211,67
4	Rzodkiewka	136,65
5	Kapusta pekińska	223,3

Wnioski:

Jak widać z danych w tabeli najwięcej katalazy jest w obu rodzajach kapusty (włoska i pekińska), znaczne ilości tego enzymu występują także w ziemniaku i rzodkiewce. Natomiast enzym peroksydaza w największych ilościach występuje w chrzanie w porównaniu z innymi produktami.