Biochemia

laboratorium

Ćwiczenie 8:

OKSYDOREDUKTAZY

Sprawozdanie poprawione 13.06.2011

grupa:

Katarzyna Kędzierska 144530

Dominika Kępska

Justyna Dabrowska

kierunek Biotechnologia

grupa dziekańska: III

semestr: IV

data wykonania ćwiczenia: 19.05.2011

data oddania sprawozdania 26.05.2011

1. Wstęp teoretyczny:

pokarm +  O₂  →  H₂O +  CO₂ ↑   + energia

• Dehydrogenazy – katalizują bezpośrednie odwodorowanie substratu, przenoszą protony i elektrony z substratu na koenzym (NAD⁺, NADP⁺, FMN, FAD), wymagają układów pośredniczących, które przenoszą pobrane elektrony na tlen

• Reduktazy – katalizują przeniesienie protonów i elektronów lub samych elektronów pomiędzy przenośnikami np. wewnątrz łańcucha oddechowego

• Oksygenazy – katalizują przyłączanie tlenu do związku organicznego, dzielimy je na:

• Oksygenazy właściwe

• Oksygenazy mieszane

• Oksydazy – przenoszą elektrony i protony z donora na tlen cząsteczkowy, produktami ich reakcji są: utleniony związek organiczny, woda lub nadtlenek wodoru, dzielimy je na:

• Oksydazy wytwarzające wodę

• Oksydazy wytwarzające nadtlenek wodoru

• Enzymy rozkładające nadtlenek wodoru – żelazoproteiny, zawierające hem jako grupę prostetyczną, dzielimy je na

• Peroksydazy

• Katalazy

1. Część doświadczalna:

1. Przygotowanie ekstraktu enzymatycznego:

• Analizowany surowiec (banan, rzodkiewka, kapusta włoska, chrzan) umyliśmy, oddzieliliśmy części niejadalne i rozdrobniliśmy (w przypadku chrzanu starliśmy na tarce). Naważkę 20 g tak przygotowanego wstępnie surowca roztarliśmy w moździerzu do uzyskania jednorodnej masy. Inne surowce były ewentualnie ucierane z dodatkiem piasku szklanego. Próbę przenieśliśmy ilościowo do kolby stożkowej z podziałką o pojemności 200 ml, dodaliśmy 0,5 g CaCO₃, uzupełniliśmy wodą destylowaną do kreski, wymieszaliśmy i po 15 min przesączyliśmy.

1. Analiza jakościowa:

• Celem doświadczenia jest wykrycie obecności w analizowanym surowcu (banan, rzodkiewka, kapusta włoska, chrzan) enzymów oksydoredukcyjnych: katalazy (CAT), oksydazy orto-difenolowej (PPO) i peroksydazy (POD).

• Doświadczenie polega na zaobserwowaniu widocznych efektów wizualnych (bądź ich braku): zmiany zabarwienia lub pojawienia się pęcherzyków gazu.

• Wykonanie: Do 6 probówek dodaliśmy po 5 ml ekstraktu enzymatycznego z chrzanu otrzymanego wg punktu 1, oraz odczynników jak poniżej:
  1 – próba odniesienia – badany ekstrakt enzymatyczny
  2 – wykrywanie katalazy – badany ekstrakt enzymatyczny + ok. 10 kropli 1% roztworu nadtlenku wodoru (H₂O₂)
  3 – wykrywanie oksydazy orto-difenolowej – badany ekstrakt enzymatyczny + ok. 10 kropli 1% roztworu katecholu
  4 – wykrywanie oksydazy orto-difenolowej – badany ekstrakt enzymatyczny + ok. 10 kropli 1% roztworu pirogalolu
  5 – wykrywanie peroksydazy – badany ekstrakt enzymatyczny + ok. 10 kropli 1% roztworu katecholu + ok. 10 kropli 1% roztworu nadtlenku wodoru (H₂O₂)
  6 - wykrywanie peroksydazy – badany ekstrakt enzymatyczny + ok. 10 kropli 1% roztworu pirogalolu + ok. 10 kropli 1% roztworu nadtlenku wodoru (H₂O₂)
  Zawartość probówek wymieszaliśmy i obserwowaliśmy zachodzące w probówkach zmiany w porównaniu do próby odniesienia.

• Obserwacje:
  Tabela nr 1: Wyniki analizy jakościowej aktywności katalazy, oksydazy orto-difenolowej i peroksydazy w ekstrakcie enzymatycznym z chrzanu.

Enzym	Nr probówki	Próba	Opis próby	Wynik analizy
Próba odniesienia	1	Ekstrakt	-	-
Katalaza	2	Ekstrakt + nadtlenek wodoru (H2O2)	Wydzielanie się śladowej ilości pęcherzyków gazu	+/-
Oksydaza orto-difenolowa	3	Ekstrakt + katechol	Roztwór zabarwił się na kolor szaroróżowy	+
	4	Ekstrakt + pirogalol	Roztwór zabarwił się na kolor cytrynowy	+
Peroksydaza	5	Ekstrakt + katechol + nadtlenek wodoru (H2O2)	Wydzielanie się średniej ilości pęcherzyków gazu + roztwór zabarwił się na kolor intensywnie czarny	+++
	6	Ekstrakt + pirogalol + nadtlenek wodoru (H2O2)	Wydzielanie się dużej ilości pęcherzyków gazu + roztwór zabarwił się na kolor brunatny	+++

Interpretacja wyników analizy:
- brak aktywności enzymu
+/- śladowa aktywność enzymu,
+, ++, +++ mała, średnia, duża aktywność enzymu

H₂O₂ + H₂O₂ → 2H₂O + O₂↑

1. Analiza ilościowa:

• Celem doświadczenia jest określenie i porównanie aktywności enzymów: katalazy, oksydazy orto-difenolowej i peroksydazy.

1. Oznaczenie aktywności katalazy:

• Wykonanie: W dwóch kolbach stożkowych o pojemności 200 cm³ umieściliśmy po 10 cm³ ekstraktu enzymatycznego otrzymanego wg punktu 1 i po 25 cm³ wody destylowanej.
  Próba odniesienia (a): do kolby dodaliśmy 5 cm³ 10% roztworu kwasu siarkowego (VI), a następnie 3 cm³ 1% roztworu nadtlenku wodoru.
  Próba właściwa (b): do kolby dodaliśmy 3 cm³ 1% nadtlenku wodoru, oraz zapisaliśmy czas inicjacji reakcji. Po 30 minutach inkubowania roztworu w temperaturze pokojowej na stole laboratoryjnym dodaliśmy 5 cm³ 10% roztworu kwasu siarkowego (VI).
  Obie próby zmiareczkowaliśmy 0,1 M KmnO₄, do uzyskania różowego zabarwienie, nie znikającego przez 30 sekund.

$$\text{CAT\ }\left\lbrack U/g \right\rbrack = \frac{\left( a - b \right) \bullet V_{\text{ekst}} \bullet 250}{V_{\text{enz}} \bullet m_{\text{prod}} \bullet t} = \frac{\left( 32,4 - 29,3 \right) \bullet 200 \bullet 250}{10 \bullet 20 \bullet 30} = \frac{155}{6} = 25,83\ \left\lbrack \frac{U}{g} \right\rbrack$$

• Zasada działania: Zasada oznaczania aktywności katalazy (CAT) polega na odmiareczkowaniu, nierozłożonego przez katalazę, nadtlenku wodoru, roztworem KMnO₄ w środowisku kwasu siarkowego (VI).
  Jednostką aktywności katalazy jest w tym przypadku 1 U, czyli 1 µmol nadtlenku wodoru rozłożony w temperaturze 20°C w ciągu 1 minuty.
  Aktywność katalazy w produkcie podajemy w jednostkach aktywności enzymu zawartych w 1 gramie produktu [U/g].

2KMnO₄ + 5H₂O₂ + 4H₂SO₄ → 2KHSO₄ + 2MnSO₄ + 8H₂O + 5O₂

H₂O₂ + H₂O₂ → 2H₂O + O₂↑

1. Oznaczenie aktywności oksydazy orto-difenolowej:

• Wykonanie: Przygotowaliśmy 2 probówki, do których dodaliśmy:
  1 – próba kontrolna – 4 cm³ 10 mM r-ru katecholu + 2 cm³ 0,1 M r-ru buforu fosforanowego o pH 7
  2 – próba właściwa – 4 cm³ 10 mM r-ru katecholu + 1,5 cm³ 0,1 M r-ru buforu fosforanowego o pH 7 + 0,5 cm³ r-ru enzymatycznego (dodaliśmy go bezpośrednio przed pomiarem kolorymetrycznym)
  Zmierzyliśmy absorbancję próby właściwej wobec próby kontrolnej w czasie zerowym (A₀) i po 1 minucie (A_1min) przy długości fali λ=420 nm.

$$Aktywnosc\ PPO\ \left\lbrack \frac{u}{g_{\text{produktu}}} \right\rbrack = \frac{A \bullet V_{\text{ekst}}}{0,01 \bullet V_{\text{enz}} \bullet m_{\text{prod}}} = \frac{\left( A_{1min} - A_{0} \right) \bullet V_{\text{ekst}}}{0,01 \bullet V_{\text{enz}} \bullet m_{\text{prod}}} = \frac{\left( 0,375 - 0,311 \right) \bullet 200}{0,01 \bullet 0,5 \bullet 20} = \frac{12,8}{0,1} = 128\ \left\lbrack \frac{u}{g_{\text{produktu}}} \right\rbrack$$

• Zasada działania: Zasada oznaczenia aktywności oksydazy orto-difenolowej (PPO) opiera się o spektrofotometryczne oznaczenie barwnych produktów, powstających w reakcji utleniania katecholu przez tlen atmosferyczny, katalizowanej przez oksydazę orto-difenolową. Mierzymy tu przyrost absorbancji mieszaniny reakcyjnej zawierającej katechol i ekstrakt enzymatyczny w czasie 1 minuty.
  Jednostką aktywności oksydazy orto-difenolowej jest tu 1 u, czyli przyrost absorbancji o 0,01 w temperaturze 20°C w ciągu 1 minuty w warunkach prowadzenia oznaczenia.
  Aktywność oksydazy orto-difenolowej podamy w jednostkach aktywności enzymatycznej zawartej w 1 gramie produktu [u/g produktu].

• Równanie reakcji utleniania katecholu przez tlen atmosferyczny, katalizowanej przez oksydazę orto-difenolową:

1. Oznaczenie aktywności peroksydazy:

• Wykonanie: Przygotowaliśmy 2 probówki do których dodaliśmy:
  1 - próba kontrolna – 5 cm³ 0,1 M buforu fosforanowego o pH 7 + 1 cm³ 2 mM r-ru gwajakolu + 1 cm³ekstraktu enzymatycznego
  2 – próba właściwa - – 5 cm³ 0,1 M buforu fosforanowego o pH 7 + 1 cm³ 2 mM r-ru gwajakolu + 1 cm³ekstraktu enzymatycznego + 2 krople 12,3 mM nadtlenku wodoru (dodaliśmy go bezpośrednio przed pomiarem kolorymetrycznym).
  Zmierzyliśmy absorbancję próby właściwej wobec próby kontrolnej przy długości fali λ=436 nm w czasie zerowym (A₀) i po 1 minucie (A_1min).

$$Aktywnosc\ POD\ \left\lbrack \frac{u}{g_{\text{produktu}}} \right\rbrack = \frac{A \bullet V_{\text{ekst}}}{0,01 \bullet V_{\text{enz}} \bullet m_{\text{prod}}} = \frac{\left( A_{1min} - A_{0} \right) \bullet V_{\text{ekst}}}{0,01 \bullet V_{\text{enz}} \bullet m_{\text{prod}}} = \frac{\left( 0,402 - 1,015 \right) \bullet 200}{0,01 \bullet 1 \bullet 20} = \frac{122,6}{0,2} = 613\ \left\lbrack \frac{u}{g_{\text{produktu}}} \right\rbrack$$

• Zasada działania: Zasada oznaczenia aktywności peroksydazy (POD) opiera się o spektrofotometryczne oznaczenie barwnych produktów, powstających w reakcji utleniania gwajakolu (substrat aromatyczny) przez nadtlenek wodoru, katalizowanej przez peroksydazę. Mierzymy tu przyrost absorbancji mieszaniny reakcyjnej zawierającej gwajakol i ekstrakt enzymatyczny oraz nadtlenek wodoru w czasie 1 minuty.
  Jednostką aktywności peroksydazy jest tu 1 u, czyli przyrost absorbancji o 0,01 w temperaturze 20°C w ciągu 1 minuty w warunkach prowadzenia oznaczenia.
  Aktywność peroksydazy podamy w jednostkach aktywności enzymatycznej zawartej w 1 gramie produktu [u/g produktu].

• Równanie reakcji utleniania gwajakolu przez nadtlenek wodoru, katalizowanej przez peroksydazę:

1. Wyniki analizy:
   Tabela nr 2: Aktywność katalazy, oksydazy orto-difenolowej i peroksydazy w analizowanych surowcach.

Surowiec	Analiza jakościowa	Analiza ilościowa
	katalaza	oksydaza orto-difenolowa
Banan	+++	++
	+++	++
Rzodkiewka	+	-
	++	-
Kapusta włoska	+++	+/-
	+++	+/-
Chrzan	+/-	+/-
	+/-	+/-

5. Wnioski:
   Z tabelki z wynikami analiz jakościowej i ilościowej, a dokładniej poprzez wyliczone aktywności enzymów, możemy zaobserwować, że:

• najwięcej enzymu katalazy znajduje się w kapuście włoskiej, gdyż aktywność tego enzymu wynosiła tu 261,25 – 321,67

• najmniej enzymu katalazy znajduje się w chrzanie, gdyż aktywność tego enzymu wynosiła tu 10,0 – 25,63

• najwięcej enzymu oksydazy orto-difenolowej znajduje się w bananie, gdyż aktywność tego enzymu wynosiła tu 944 - 1084

• najmniej enzymu oksydazy orto-difenolowej znajduje się w rzodkiewce, gdyż aktywność tego enzymu wynosiła tu 8 - 58

• najwięcej enzymu peroksydazy znajduje się w chrzanie, gdyż aktywność tego enzymu wynosiła tu 437 - 613

• najmniej enzymu peroksydazy znajduje się w bananie, gdyż aktywność tego enzymu wynosiła tu 7

Ponadto można zaobserwować zależność pomiędzy aktywnością (obecnością) enzymu katalazy, a enzymu peroksydazy: mianowicie im większa aktywność katalazy, tym mniejsza aktywność peroksydazy, czyli im więcej katalazy w surowcu, tym mniej jest peroksydazy.
Powinno się też zauważyć brak odzwierciedlenia wyników analizy ilościowej w wynikach analizy jakościowej, co jest spowodowane niedokładnością analizy jakościowej. Analiza jakościowa ma za zadanie jedynie wykryć daną substancję, a nie wykazywać jej ilość w badanej próbce.