Monika Wrońska

Daria Świerczyńska

Dawid Piątkowski

Tomas Tomasewic

LABORATORIUM Z BIOCHEMII.

ĆWICZENIE 1

AMINOKWASY

Data wykonania ćwiczenia: 09.03.2011 r.

Data oddania sprawozdania: 16.03.2011 r.
Data zwrotu sprawozdania: 23.03.2011 r.
Data powtórnego oddania sprawozdania: 30.03.2011 r.

Semestr IV

Grupa V

Środa 14¹⁵- 18⁰⁰

1. Wstęp teoretyczny:

Związki organiczne, pochodne węglowodorów, zawierające co najmniej jedną grupę aminową (-NH₂) i jedną grupę karboksylową (-COOH). Inaczej mówiąc są to kwasy karboksylowe alifatyczne lub aromatyczne, zawierające w cząsteczce oprócz grupy karboksylowej -COOH, grupę aminową -NH₂.

Rys.1 Wzór ogólny aminokwasów.

Aminokwasy są związkami amfoterycznymi:
- w środowisku o pH niższym od ich punktu izoelektrycznego (pI) występują jako kationy (-NH₃⁺) i mogą reagować z anionami
- w środowisku o pH wyższym od pI tworzą aniony (-COO^-) i reagują z kationami.
W pI tworzą jony obojnacze, czyli elektrycznie obojętne.

Rys.2 Wzór ogólny aminokwasów a) kation, b) jon obojnaczy, c) anion.

Wyróżnia się aminokwasy:
- obojętne (pI przy pH ok. 6,3),
- zasadowe (pI w zakresie zasadowym pH)
- kwaśne (pI w zakresie kwaśnym pH).

Podział aminokwasów:

• Aminokwasy egzogenne i endogenne

Aminokwasy egzogenne są to aminokwasy, które nie są syntetyzowane w organizmie ludzkim, a ich obecność w białkach spożywanych decyduje o wartości odżywczej. Histydyna jest niezbędna dla dzieci do 12 roku życia, ale nie jest niezbędna dla dorosłych.
Aminokwasy endogenne są to aminokwasy, które są syntezowane w organizmie ludzkim.

Aminokwasy egzogenne to:

Lizyna, Metionina, Leucyna , Izoleucyna, Histydyna, Fenyloalanina, Treonina, Tryptofan, Walina.

Aminokwasy endogenne to:

Alanina, Glicyna, Asparagina, Glutamina, Seryna, Cysteina, Prolina, Arginina , Tyrozyna.

• Ze względu na polarność grup R w sąsiedztwie węgla α wyróżniamy:

-aminokwasy polarne – do których zaliczymy: argininę, asparaginę, lizynę, cysteinę, glutaminę, tyrozynę, treoninę, serynę, histydynę, kwas asparaginowy i glutaminowy;

-aminokwasy niepolarne – do których zaliczymy: glicynę, alaninę, leucynę, izoleucynę, metioninę, fenyloalaninę, prolinę i walinę.

ze względu na liczbę grup aminowych i karboksylowych w cząsteczce wyróżniamy:

-aminokwasy obojętne - gdy liczba grup aminowych i karboksylowych jest taka sama np.:

      izoleucyna (Ile)                                leucyna (Leu)

          

-aminokwasy kwaśne – gdy liczba grup karboksylowych przeważa nad liczbą grup aminowych np.:

kwas glutaminowy (Glu)                       kwas asparaginowy (Asp)

-aminokwasy zasadowe – gdy liczba grup aminowych przeważa nad liczbą grup karboksylowych np.:

arginina (Arg)                                           lizyna (Lys)

Aminokwasy budują białka i tkankę mięśniową. Mają one wpływ na procesy fizjologiczne związane z uprawianiem sportu takie jak: regeneracja energii, rozwijanie mięśni, utlenianie tłuszczów czy na nastrój i pracę umysłową. Naturalne aminokwasy stosuje się jako leki w przypadkach upośledzonej gospodarki białkowej, powstającej na wskutek np. nieprawidłowego przyswajania białka albo utraty związanej z przewlekłymi chorobami, operacjami chirurgicznymi, marskością wątroby. Substancje te, szczególnie pochodzenia naturalnego są także wykorzystywane jako substraty w syntezie innych leków.

1. Część doświadczalna

1. Amfoteryczne właściwości aminokwasów.

Cel ćwiczenia: Pokazanie, że aminokwasy posiadają właściwości amfoteryczne.

Materiały: stały preparat L-tyrozyny, 0,1 M roztwór HCl, 0,05 M roztwór NaOH.

Przebieg doświadczenia i obserwacje: Po rozpuszczeniu L- tyrozyny w ok. 10-15 kroplach HCl dodawaliśmy powoli 0,05 M NaOH kroplami, aż do pojawienia się osadu w kształcie przeźroczystych igiełek. Następnie próbę zalkalizowaliśmy poprzez dodanie bardziej stężonej zasady NaOH, aż do rozpuszczenia osadu.

Wnioski: Poprzez zmianę pH związku wykazaliśmy że aminokwasy posiadają właściwości amfoteryczne. Spowodowane jest to obecnością grupy aminowej i karboksylowej. W roztworach wodnych występują głównie w formie jonów. W zależności od pH środowiska jony te mogą mieć charakter kwasowy bądź zasadowy. W przeprowadzonym doświadczeniu rozpuszczając L- tyrozynę w HCl wykazaliśmy zasadowy charakter aminokwasów gdyż reagują z kwasami. Następnie dodając NaOH, aż do pojawienia się osadu wykazaliśmy ze aminokwasy mają charakter kwasowy i reagują z zasadami tworząc sole ( osad soli sodowej aminokwasu w postaci przeźroczystych igiełek).

1. Odczyn ninhydrynowy.

Cel ćwiczenia: Wykrycie obecności aminokwasów w probówce.

Materiały: 0,5% roztwór glicyny, 0,5% roztwór histydyny, 0,5% tryptofanu, białko kurze, woda.

Przebieg doświadczenia: W każdej probówce umieściliśmy 0,5 ml badanego związku i dodaliśmy taką samą ilość odczynnika ninhydrynowego. Probówki ogrzewaliśmy w łaźni wodnej (temperatura ok. 100° C) przez ok. 5 minut.

Obserwacje:

1. 0,5% roztwór glicyny- pojawiło się zabarwienie purpurowo-fioletowe.

2. 0,5% roztwór histydyny- pojawiło się purpurowe zabarwienie.

3. 0,5% roztwór tryptofanu- pojawiło się brunatne zabarwienie.

4. Białko kurze- pojawiło się lekko purpurowe zabarwienie.

5. Woda- nie nastąpiła żadna zmiana, roztwór bezbarwny.

Równanie reakcji:

Rys.3 Reakcja ninhydrynowa.

Wnioski: Ninhydryna powoduje oksydacyjną dekarboksylację aminokwasów, w wyniku cze­go powstają CO₂, NH₃ i aldehyd uboższy o jeden atom węgla w porównaniu z macierzys­tym aminokwasem. Zredukowana ninhydryna reaguje wtedy z uwolnionym amoniakiem, two­rząc purpurowo-fioletowy kompleks, który absorbuje świat­ło o długości 570 nm. Natężenie barwy powstałego kompleksu stanowi podstawę ilościowej metody oznaczania aminokwasów, za pomocą której można wykryć mikrogramowe ilości aminokwasów. Próba ninhydryny z białkiem kurzym również dała pozytywny rezultat. Spowodowane jest to faktem, iż białko jest zbudowane z aminokwasów.

1. Reakcja z kwasem azotawym ( wg. Van Slyke’a )

Cel ćwiczenia: Wykrycie obecności aminokwasów w probówce.

Materiały: 5% roztwór azotynu sodowego, 2M roztwór kwasu octowego, 0,5% roztwór glicyny, 0,5% roztwór tryptofanu, białko kurze, woda.

Przebieg doświadczenia: W czterech probówkach umieściliśmy 2 ml NaNO₂, dodaliśmy 2 ml roztworu, aby wytworzyć HNO₂. Do probówki pierwszej dodaliśmy 2,5 ml roztworu glicyny, do probówki drugiej 2,5ml roztworu tryptofanu, do probówki trzeciej 2,5 ml roztworu białka kurzego, a do probówki czwartej 2,5 ml wody.

Obserwacje:

1. 0,5% roztwór glicyny- zaobserwowaliśmy wydzielenie się pęcherzyków gazu.

2. 0,5% roztwór tryptofanu- zaobserwowaliśmy częściowo żółte zabarwienie i wydzielenie się pęcherzyków gazu.

3. Białko kurze- zaobserwowaliśmy wydzielenie się pęcherzyków gazu.

4. Woda- nie zaobserwowaliśmy żadnych zmian.

Równanie reakcji:

Rys.4 Reakcja Van Slyke’a. Powstaje hydroksykwas.

Wnioski: Kwas azotawy spowodował dezaminacje aminokwasów czego rezultatem było wydzielenie się cząsteczek azotu w postaci pęcherzyków gazu. Natomiast aminokwas przekształcił się w hydroksykwas o takiej samej liczbie węgli w łańcuchu. Próba z białkiem również dała pozytywny rezultat. Spowodowane jest to faktem iż białka są zbudowane z aminokwasów.

1. Reakcja ksantoproteinowa

Cel ćwiczenia: Wykrycie aminokwasów zawierających pierścień aromatyczny.

Materiały:0,5% roztwór tryptofanu, 0,5%roztwór tyrozyny, 0,5% roztwór glicyny, białko kurze, woda.

Przebieg doświadczenia: W probówkach umieściliśmy 1ml roztworu badanych substancji, dodaliśmy do każdej probówki 0,5ml stężonego HNO₃ i umieściliśmy w łaźni wodnej (temperatura ok. 100°C ) na czas ok. 30 sekund.

Obserwacje:

1. 0,5% roztwór tryptofanu- zaobserwowaliśmy czerwono pomarańczowe zabarwienie

2. 0,5% roztwór tyrozyny- zaobserwowaliśmy delikatne żółte zabarwienie

3. 0,5% roztwór glicyny- nie zaobserwowaliśmy żadnych zmian

4. Białko kurze- zaobserwowaliśmy żółte zabarwienie

5. Woda- nie zaobserwowaliśmy zmiany zabarwienia

Przebieg doświadczenia (c.d.): Poczekaliśmy aż roztwory ostygną i dodaliśmy do każdej probówki po ok. 3ml NaOH

Obserwacje (c.d.):

1. 0,5% roztwór tryptofanu- zaobserwowaliśmy krwistoczerwone zabarwienie

2. 0,5% roztwór tyrozyny- zaobserwowaliśmy pomarańczowe zabarwienie

3. 0,5% roztwór glicyny- nadal nie zauważyliśmy żadnej zmiany, roztwór bezbarwny

4. Białko kurze- zaobserwowaliśmy pomarańczowe zabarwienie

5. Woda- nadal nie zauważyliśmy żadnej zmiany, roztwór bezbarwny

Wnioski: Reakcja ta dała wynik pozytywny dla aminokwasów zawierających w swej budowie pierścień aromatyczny. W wyniku nitrowania aromatycznych ugrupowań powstaje trwałe, żółte zabarwienie. Glicyna nie posiada w swej budowie pierścienia aromatycznego więc próba dała wynik negatywny. Natomiast reakcja z białkiem kurzym dała wynik pozytywny i jest to spowodowane faktem, iż w skład białka kurzego wchodzą aminokwasy zawierające pierścień aromatyczny.

1. Reakcja Millon’a (tylko dla tyrozyny)

Cel doświadczenia: Wykrycie obecności tyrozyny.

Materiały: 0,5% roztwór tyrozyny, białko kurze, woda.

Przebieg doświadczenia: W probówkach umieściliśmy po 0,5 ml badanych substancji, następnie dodaliśmy do każdej probówki po 0,5 ml odczynnika Millon’a, po czym ogrzewaliśmy w łaźni wodnej (temperatura ok. 100°C ) przez ok. 30 sekund.

Obserwacje:

1. 0,5% roztwór tyrozyny- zaobserwowaliśmy ceglasto-czerwone zabarwienie

2. Białko kurze- zaobserwowaliśmy różowy osad, nastąpiła denaturacja białka

3. Woda- nie zaobserwowaliśmy żadnych zmian

Równanie reakcji:

Rys.5 Reakcja Millon’a.

Wnioski: Reakcja Millona jest charakterystyczna dla monofenoli, a więc z aminokwasów tylko dla tyrozyny. Służy ona do ilościowego oznaczania tyrozyny metodą kolorymetryczną. Roztwór białka kurzego dał pozytywny wynik. Spowodowane jest to występowaniem w białku tyrozyny.

1. Odczyt aldehydowy wg. Rosenheim’a

Cel doświadczenia: Wykrycie obecności tryptofanu.

Materiały:0,5% roztwór tryptofanu, 0,5% roztwór glicyny, białko kurze, woda

Przebieg doświadczenia: W probówkach umieściliśmy po 1 ml badanego roztworu. Do każdej z probówek dodaliśmy 3-4 krople roztworu aldehydu mrówkowego, następnie 1ml stężonego H₂SO₄ oraz 2-4 krople nasyconego roztworu HgSO₄. Dokładnie wymieszaliśmy całość.

Obserwacje:

1. 0,5% roztwór tryptofanu- zaobserwowaliśmy ciemnobrunatny osad

2. 0,5% roztwór glicyny- nie zaobserwowaliśmy żadnej zmiany, roztwór bezbarwny

3. Białko kurze- Zaobserwowaliśmy delikatnie brunatny osad

4. Woda- nie zaobserwowaliśmy żadnej zmiany, roztwór bezbarwny

Równanie reakcji:

L-tryptofan kwas glioksalowy

Rys.6 Reakcja Rosenheim’a.

Wnioski: Tryptofan zawierający w swym łańcuchu bocznym pierścień indolowy, który w obecności czynnika utleniającego (w tym doświadczeniu jest nim aldehyd mrówkowy ) tworzy barwny produkt kondensacji. Białko kurze daje również pozytywny wynik reakcji, co spowodowane jest obecnością tryptofanu w białku.

1. Reakcja wg. Adamkiewicza- Hopkins’a

Cel doświadczenia: Wykrycie obecności tryptofanu.

Materiały: 0,5% roztwór tryptofanu, 0,5% roztwór glicyny, białko kurze, woda

Przebieg doświadczenia: W probówkach umieściliśmy po 1ml badanego roztworu. Do każdej probówki dodaliśmy kwasu glioksalowego. W każdej probówce powstał bezbarwny roztwór. Następnie dodaliśmy 1ml stężonego H₂SO₄.

Obserwacje:

1. 0,5% roztwór tryptofanu- zaobserwowaliśmy powstanie fioletowego pierścienia na granicy roztworu i kwasu

2. 0,5% roztwór glicyny- nie zaobserwowaliśmy żadnej zmiany, roztwór bezbarwny

3. Białko kurze- białko się ścięło, powstała fioletowa obrączka

4. Woda- nie zaobserwowaliśmy żadnej zmiany, roztwór bezbarwny

Wnioski: Tryptofan zawierający w swym łańcuchu bocznym pierścień indolowy, który w obecności czynnika utleniającego (w tym doświadczeniu jest nim kwas glioksalowy) tworzy barwny produkt kondensacji. Białko kurze również ulega reakcji ksantoproteinowej (powstaje fioletowa obrączka), co spowodowane jest obecnością tryptofanu w białku.

1. Odczyn Pauly’ego dla histydyny

Cel doświadczenia: Wykrycie obecności histydyny.

Materiały: 0,5% roztwór histydyny, 0,5% roztwór tyrozyny, 0,5% roztwór glicyny, białko kurze, woda.

Przebieg doświadczenia: W probówkach umieściliśmy po 1ml badanego roztworu. Do każdej probówki dodaliśmy 2ml kwasu sulfanilowego oraz 1ml azotynu sodu. Po wymieszaniu wprowadziliśmy po 1ml 30% roztworu NaOH.

Obserwacje:

1. 0,5% roztwór histydyny- zaobserwowaliśmy krwistoczerwone zabarwienie

2. 0,5% roztwór tyrozyny- zaobserwowaliśmy czerwono-pomarańczowe zabarwienie

3. 0,5% roztwór glicyny- zaobserwowaliśmy delikatne żółte zabarwienie

4. Białko kurze- powstały trzy warstwy, czerwona, pomarańczowa i żółta

5. Woda- nie zaobserwowaliśmy żadnej zmiany, roztwór bezbarwny

Wnioski: Związki imidazolowe, w tym histydyna dają czerwone zabarwienie w reakcji diazowania z kwasem sulfanilowym. Odczynnik Pauliego składa się z trzech roztworów: kwasu sulfanilowego, azotynu sodu oraz węglanu sodowego, które zmieszane tworzą kwas diazobenzenosulfonowy. W reakcji z tym samym odczynnikiem tyrozyna tworzy żółto-pomarańczowy (herbaciany) produkt reakcji diazowania. Białko kurze również daje pozytywny reakcji co spowodowane jest obecnością histydyny w białku.

1. Reakcja cystynowa.

Cel doświadczenia: Wykrycie obecności cysteiny.

Materiały: stały preparat L-cysteiny, białko kurze, woda

Przebieg doświadczenia: W probówkach umieściliśmy badane substancje. Do każdej probówki dodaliśmy octanu ołowiu, a następnie 1 ml 30% NaOH.

Obserwacje:

1. Stały preparat cysteiny- zaobserwowaliśmy rozpuszczanie kryształków cysteiny

2. Białko kurze- zaobserwowaliśmy rozpuszczenie białka kurzego

3. Woda- nie zaobserwowaliśmy żadnych zmian

Przebieg doświadczenia (c.d.): Wszystkie trzy probówki umieściliśmy w łaźni wodnej (temperatura ok. 100°C ) na czas ok. 30 minut. Po wyjęciu z łaźni wodnej w probówce ze stałym preparatem cysteiny i w probówce z białkiem kurzym pojawił sie szarawo-czarny osad.

Wnioski: Aminokwasy siarkowe z grupami –SH lub –S-S- (zarówno w stanie wolnym lub związanym w białkach), podczas ogrzewania w środowisku silnie alkalicznym,

przekształcając się w kwas pirogronowy, uwalniają siarkę w postaci jonów

siarczkowych. Jony siarczkowe reagują z jonami ołowiu (II), dając czarny osad

PbS. Dodatkowym produktem jest amoniak. Białko kurze również ulega reakcji cysty nowej, co spowodowane jest obecnością cysteiny w białku.