Bakterie mlekowe – właściwości i zastosowanie

Czystą kulturę bakterii mlekowych po raz pierwszy wyodrębnił Lister w roku 1880 i była to kultura Streptococcus lactis (obecnie Lactococcus lactis – paciorkowiec mleczny).

Bakterie fermentacji mlekowej zaliczane są do rodzajów:

• Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc i Pediococcus.

• Praktycznie jednak ta grupa bakterii często jest rozszerzana (nie bez kontrowersji) na bakterie z rodzajów: Bifidobacterium, Carnobacterium, Enterococcus, Propionibacterium, Sporolactobacillus, Streptococcus a nawet Listeria.

Charakterystyka bakterii mlekowych:

• produkują kwas mlekowy z cukrów w procesie fermentacji,

• gram dodatnie,

• długie i krótkie pałeczki i ziarniaki typu paciorkowcowego,

• metabolizm fermentacyjny,

• względnie lub bezwzględnie beztlenowe,

• optimum pH: 5,5-5,8

• mezo- lub termofilne,

• złożone wymagania pokarmowe w stosunku do aminokwasów, peptydów, zasad nukleinowych, witamin, minerałów, kwasów tłuszczowych i węglowodanów

• najważniejsze rodzaje: Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus (Bifidobacterium, Carnobacterium, Enterococcus, Propionibacterium, Sporolactobacillus, Streptococcus, Listeria)

• brak wytwarzania przetrwalników – nie wytwarzają one przetrwalników ani żadnych innych form typu powiedzmy endospor, jeden wyjątek – jest nim Bacillus coagulans (dawniej B. dextrolacticus)

• brak ruchu - bakterie mlekowe są pozbawione możliwości samodzielnego poruszania się

• brak zdolności do rozpuszczania żelatyny, w tym wypadku istnieje jeden wyjątek, jest nim mianowicie Streptococcus faecalis subsp. Liquefaciens

• brak wytwarzania katalazy.

Wymagania pokarmowe:

Charakteryzują się dość wysokimi wymaganiami odżywczymi, tzn. najlepiej rozwijają się na tzw. pożywkach naturalnych, takich jak mleko, serwatka, brzeczka niechmielona itd.

Natomiast o wiele gorzej , a więc trudniej jest je hodować na pożywkach syntetycznych.

W tym wypadku bardziej jeszcze wybredne są pałeczki mlekowe.

Natomiast wśród ziarniaków mlekowych niektóre są bardziej tolerancyjne i mogą być hodowane na podłożach syntetycznych, względnie na podłożach syntetycznych uzupełnionych niektórymi tylko składnikami specjalnie przez te bakterie wymaganymi.

Ta wybiórcza często wrażliwość bakterii mlekowych, nieraz odnosząca się do poszczególnych aminokwasów czy poszczególnych witamin, wykorzystana została i jest dość szeroko stosowana obecnie w analityce. Posługujemy się do tego mutantami, które sztucznie są upośledzone do syntezy jakiegoś pojedynczego składnika i wtedy szczepy także mogą być wykorzystane do tzw. biologicznego oznaczania tych składników, tzn. witamin czy poszczególnych aminokwasów. Jak się okazuje, dokładność tych metod analitycznych nie ustępuje metodom chemicznym, czasem dokładność tych pierwszych jest większa, a przede wszystkim pod względem technicznym taka analiza jest wiele prostsza niż przeprowadzenie analizy chemicznej.

Podział systematyczny:

Istnieje szereg systemów. Duński bakteriolog, Orl-Jensen dzieli bakterie mlekowe na dwie zasadnicze grupy:

1. Bakterie właściwej fermentacji mlekowej:

• bakterie homofermentacji mlekowej – trzy rodzaje: Lactococcus, Lactobacillus i Lactobacillus.

• bakterie heterofermentacji mlekowej – wyróżnia zasadniczo dwa rodzaje: Betacoccus (inaczej Leuconostoc) oraz Lactobacillus. Trzecim rodzajem zaliczanym tu jest Bifidobacterium, które wchodzą w skład mikroflory przewodu pokarmowego dzieci karmionych mlekiem matki

2. Bakterie psedofermentacji mlekowej:

• Tetracoccus zwany inaczej Micrococcus

• Microbacterium

Chemizm fermentacji mlekowej:

1. Homofermentacja mlekowa – glikoliza – kwas pirogronowy ulega redukcji przy udziale dehydrogenazy mleczanowej do kwasu mlekowego

2. Hetero fermentacja – oprócz kwasu mlekowego powstają inne produkty

Z aldehydu fosfoglicerynowego powstają:

• kwas mlekowy – główny produkt finalny

• alkohol etylowy

• kwas octowy

Z fofofihydroksyacetonu powstaje:

• glicerol

Techniczne wykorzystanie:

• wykorzystanie bakterii fermentacji mlekowej do bezpośredniej biosyntezy określonych metabolitów, które są wytwarzane podczas ich rozwoju i wykorzystania ich do celów pośrednich w sensie przerobu lub utrwalenia niektórych produktów spożywczych

• największa rola przypada tutaj produkcji kwasu mlekowego na drodze mikrobiologicznej. Stosowane są przede wszystkim pałeczki mlekowe ponieważ charakteryzują się one zdolnością wytwarzania większych ilości kwasu mlekowego – przynajmniej w granicach 1,5% a czasem nawet do 2% kwasu mlekowego.

Istnieją dwie metody produkcji kwasu mlekowego:

• synteza chemiczna

synteza chemiczna polega na hydrolizie nitrylomleczanu (cyjanohydryny aldehydu octowego) tworzonego w wyniku reakcji aldehydu octowego z cyjanowodorem

• synteza mikrobiologiczna (biosynteza)

kwas mlekowy (kwas 2-hydroksypropanowy, dawniej też α-hydroksypropionowy) jest wytwarzany w trzech odmianach, tj. lewo D(-) i prawoskrętnej L(+) oraz optycznie nieczynnej (racemicznej DL), tj. zawierającej równe ilości kwasu prawoskrętnego i lewoskrętnego

Roczna wydajność tych metod na świecie wynosi aktualnie 35 tys. ton.

W zależności od surowca, który może być wykorzystany do mikrobiologicznej produkcji kwasu mlekowego stosuje się odpowiednie gatunki bakterii fermentacji mlekowej. Właściwie dzisiaj do tego celu najszerzej są wykorzystywane dwa zasadnicze surowce odpadowe, mianowicie serwatka, która stanowi produkt odpadowy przemysłu mleczarskiego, gdzie powstaje w dużych ilościach i właściwie dzisiaj ciągle jeszcze jest dość kłopotliwym produktem ubocznym i nie wiadomo co z nim zrobić. Dlatego bardzo pożądane jest wykorzystanie go do celów produkcyjnych jeśli chodzi o syntezę kwasu mlekowego.

Kwas mlekowy wytwarzany jest w 3 odmianach:

1. lewoskrętnej – D(-)

• nie jest szkodliwy dla organizmu, ale nie może być wykorzystany do celów energetycznych lub budowy komórek, jest on powoli wydalany

1. prawoskrętnej – L(+)

• jest przyswajalny przez organizm ludzki i zwierzęcy

1. optycznie nieczynnej: racemicznej – DL

Synteza chemiczna prowadzi do otrzymania racemicznego kwasu mlekowego, natomiast metodą biosyntezy otrzymuje się kwas zawierający więcej formy L(+). Tworzenie się kwasu D(-), L(+) lub DL zależy od stereospecyficzności pośredniczącego enzymu – dehydrogenazy mleczanowej oraz od obecności racemazy mleczanowej. Można też zastosować takie szczepy bakterii, które wytwarzają prawie wyłącznie kwas mlekowy prawoskrętny.

Kwas mlekowy łatwo tworzy podczas ogrzewania estry, w których jedna cząsteczka hydroksykwasu odgrywa rolę alkoholu, druga zaś – kwasu. W ten sposób tworzy się liniowy dimer – kwas laktylomlekowy i wyższe liniowe polimery. Podczas dalszego ogrzewania, odbywa się wewnątrzkomórkowa estryfikacja, w wyniku której powstają cykliczne laktydy. Te ostatnie stanowią punkt wyjścia dla syntezy biodegradowalnych polimerów kwasu mlekowego.

Drugim surowcem , który również ma charakter produktu odpadowego jest melasa.
W zależności od rodzaju substratu, a więc od tego, czy do produkcji użyta zostanie serwatka czy też melasa, dobierane są odpowiednie kultury bakterii.

Poza serwatką i melasą również polisacharydy, jak np. skrobia kukurydzy lub ziemniaków czy inulina topinamburu, po uprzedniej hydrolizie enzymatycznej lub chemicznej, mogą być wykorzystane w procesach fabrycznej biosyntezy kwasu mlekowego. Pałeczki mlekowe Lactobacillus brevis znane są z wysokiej efektywności fermentowania ksylozy i innych pentoz na kwas mlekowy i octowy. Także ługi posulfitowe, po ich zobojętnieniu i wzbogaceniu w niezbędne czynniki wzrostowe (np. przez dodanie kiełków słodowych) mogą być w opłacalny sposób fermentowane na kwas mlekowy przez paleczki L. plantarum.

Produkcja kwasu mlekowego w oparciu o serwatkę jako produkt odpadowy przemysłu mleczarskiego:

Podstawowym węglowodanem, który występuje w mleku, a zatem również i w serwatce, jest laktoza i dlatego też tutaj musi być użyta taka kultura bakterii mlekowej, która byłaby w stanie maksymalnie wykorzystać ten rodzaj źródła węgla, jakim jest laktoza. Okazało się, że najbardziej odpowiednie do tego celu kultury uzyskuje się w obrębie gatunków Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus lub L. helveticu, przy czym pierwszy z nich jest częściej wykorzystywany. Obydwa gatunki odfermentowują zarówno serwatkę naturalną jak i permeat serwatkowy (pozostałość po odbiałczeniu serwatki metodą ultrafiltracji).

Proces syntezy kwasu mlekowego w oparciu o wykorzystanie Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, to ten proces, podobnie zresztą jak i inne tego typu procesy o charakterze mikrobiologicznym, rozpada się na kilka etapów, które w pierwszej kolejności prowadzą do uzyskania odpowiednio dużej ilości inokulum potrzebnego do wzbudzenia fermentacji mlekowej w kadzi produkcyjnej, gdzie następuje właściwy proces przemiany laktozy na kwas mlekowy.

Etapy produkcji:

1. Jałowy roztwór mleka odtłuszczonego do namnażania inoculum Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus w ilości około 1 litra inkubuje w optymalnej dla tego gatunku temperaturze 43°C w ciągu 24 godzin

2. Po tym czasie całą zawartość mleka z namnożoną kulturą bakterii przelewa się do wypasteryzowanego również odtłuszczonego mleka w ilości około 45 litrów w odpowiednim balonie szklanym i inkubuje w tych samych warunkach co poprzednio

3. Po tym czasie przelewa się do naczynia o większej pojemności (1900 l) podłoże ze spasteryzowanej serwatki , adaptacja inoculum w temperaturze 43°C w ciągu 24 godzin

• Koniec produkcji inoculum zarodkowego.

(Środowisko jest lepiej opanowane im większa jest zawiesiana)

Produkcja przemysłowa:

1. Następny etap to już jest proces właściwej produkcji przemysłowej, która jest prowadzona najczęściej w kadziach wykonanych z nierdzewnej stali kwasoodpornej.
   Pojemność kadzi fermentacyjnej wynosi około 20 m3 i zawiera ona również serwatkę spasteryzowanej, do której wlewa się całą objętość przygotowanego wcześniej inokulum bakterii Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

Temperatura jest utrzymywana na tym samym poziomie 43°C, natomiast okres fermentacji jest tutaj dłuższy, tj. 42-45 godz., w trakcie fermentacji głównej prowadzi się okresowe zobojętnianie wytwarzającego się kwasu mlekowego. Po upływie każdych kolejnych 6 godzin wprowadza się do fermentującego podłoża porcję wodorotlenku wapnia (wapna gaszonego) , który wiąże wytwarzający się kwas mlekowy i przemienia go na mleczan wapnia, przy czym ilość tego środka neutralizującego dodawana jest w taki sposób, aby stężenie wolnego kwasu mlekowego nie przekraczało 0,6%, ponieważ bakterie mlekowe wytwarzają kwas mlekowy i posiadają pewną naturalną tolerancję na jego działanie.

1. Po osiągnięciu maksymalnej granicy wytrzymałości, tzn. około 2%, w ogóle dalszy proces przemiany laktozy na kwas mlekowy ulega całkowitemu zahamowaniu. Aby temu zapobiec wprowadza się środki neutralizujące i w ten sposób proces ukwaszania może być przedłużony i cała ilość zawartych węglowodanów, a więc zawartej laktozy, może być w ten sposób przemieniona na kwas mlekowy, a ten z kolei na mleczan wapnia poprzez wprowadzenie środków neutralizujących.

Uzyskany w ten sposób roztwór mleczanu wapnia, lekko jeszcze podkwaszony, podlega oczyszczeniu poprzez wprowadzenie partii ziemi okrzemkowej i węgla aktywnego.

Wyklarowany roztwór mleczanu wapnia kierowany do dalszych operacji technologicznych, tzn. do pozgęszczania, krystalizacji i przemywania.

1. Proces zagęszczenia mleczanu wapnia przeprowadzany jest w urządzeniach zwanych wyparkami, przy czym proces ten jest prowadzony w warunkach obniżonego ciśnienia, tzn. prowadzi się go przy podciśnieniu 625 mm Hg. Chodzi o to, żeby pozbyć się pewnej ilości wody, ale aby uczynić to w taki sposób, żeby nie spowodować rozkładu mleczanu wapnia, a więc działać temperaturą niezbyt wysoką.

2. Proces krystalizacji- odbywa się w krystalizatorach o podwójnych ściankach, miedzy którymi cyrkuluje woda, co powoduje oziębianie roztworu do temp. 10-15 stopni

Asortyment kwasu mlekowego, który się uzyskuje w procesie jego mikrobiologicznej produkcji:
- kwas mlekowy techniczny,
- kwas mlekowy spożywczy,
- kwas mlekowy czysty.

Kwas mlekowy techniczny jest najmniej oczyszczony. Nie prowadzi się jego krystalizacji. Uzyskuje się go z roztworu mleczanu wapnia, po jego odbiałczeniu i po traktowaniu węglem aktywnym i ziemią okrzemkową. W ten sposób wstępnie oczyszczony roztwór mleczanu wapnia pozgęszcza się do 13,5° Be, rozszczepia traktując odpowiednią porcją kwasu siarkowego i po oddzieleniu gipsu w tych warunkach uzyskuje się roztwór kwasu mlekowego o stężeniu około 22%, z tym, że może być on oczywiście podgęszczony nawet w granicach 44-50%. W każdym razie ma on postać ciemnego płynu, który jest pakowany w beczkach drewnianych i w ten sposób rozprowadzany.

W przypadku kwasu mlekowego spożywczego jego stopień czystości jest wyższy. Uzyskiwany jest on już z przemytych kryształów mleczanu wapnia po pierwszej jego krystalizacji, następnie rozszczepiany jest kwasem siarkowym i uzyskuje się w rezultacie tego kwas mlekowy, który jest przezroczysty jak woda o koncentracji od 44-50% i w handlu w takiej formie jest on wprowadzany po rozlaniu do butelek.

Jeśli chodzi o kwas mlekowy czysty, to ten jest oczyszczony w najwyższym stopniu i przeznaczony dla potrzeb przemysłu chemicznego (tam, gdzie sprawa czystości odgrywa często bardzo istotna rolę). Koncentracja tego kwasu wynosi zazwyczaj około 65%. Tak wygląda proces produkcji kwasu mlekowego w oparciu o wykorzystanie serwatki.

Produkcja kwasu mlekowego na melasie:

Jeśli chodzi o produkcję kwasu mlekowego na melasie, to tutaj przede wszystkim rzecz jasna konieczne jest użycie innego szczepu bakterii. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus byłby w tym stanie rzeczy nieprzydatny, ponieważ on ma ograniczoną możliwość korzystania z węglowodanów typu sacharozy, która występuje w melasie. Dlatego też w przypadku produkcji kwasu mlekowego przy wykorzystaniu melasy jako surowca wyjściowego jako kultury produkcyjnej używa się Lactobacillus rhamnosus (dawniej L. delbrueckii). Jest to pałeczka mlekowa, dość dużych rozmiarów, która charakteryzuje się wysoką aktywnością w zakresie fermentacji glukozy lub sacharozy na kwas mlekowy.

Usprawnienia so fermentacji mlekowej w skali laboratoryjnej i pilotowej (ćwierć i półtechniczna). Dotyczy głównie produkcji kwasu mlekowego oraz odzyskiwania i czyszczenia po fermentacji

Oprócz tradycyjnej fermentacji, prowadzonej sposobem okresowym proponuje się:

• hodowlę półokresową

• pracę ze zmienną objętością czynną fermentora

• fermentacja ciągła przeprowadzona w bioreaktorach przepływowych w sposób ciagły pożywką

• fermentacja ciągła z recyrkulacją biomasy

W ostatnim wypadku fermentacja jest prowadzona przez fermentor przepływowy, odzyskany z fermentora płyn pofermentacyjny i biomasa przechodzi przez strumień z fermentora, gdzie komórki bakteryjne są zagęszczane za pomocą filtracji na różnego rodzajach membranach półprzepuszczalnych i ponownie zawracane do fermentora głównego.

Wszystkie omówione procesy mogą wykorzystywać zarówno wolne, jak i unieruchomione komórki bakterii. Do immobilizacji wykorzystuje się:

1. metodę pułapkowania komórek w żelach (agarowym, alginianowym, poliakrylamidowym lub żelach z alkoholu poliwinylowego);

2. adsorpcję w postaci błony na nośnikach stałych (materiały ceramiczne, szkło porowate, wióry polipropylenowe, pianka poliuretanowa itp.);

3. stworzenie takich warunków hodowli, w których bakterie występują w formie agregatów stanowiących rodzaj ich naturalnej immobilizacji.

W najnowszych rozwiązaniach, utworzony w czasie fermentacji kwas mlekowy może być usuwany i oczyszczany po zakończeniu fermentacji lub w czasie jej trwania przy użyciu dializy lub elektrodializy, odwróconej osmozy, destylacji, mikro- i ultrafiltracji, wymieniaczy jonowych i adsorpcji oraz ekstrakcji w różnego typu rozpuszczalnikach.