BIOTECHNOLOGIA – PRELEKCJA 1

Hodowle tkankowe (komórkowe) – hodowla komórek, tkanek i narządów/organów utrzymywanych przy życiu lub rosnących in vitro przez okres dłuższy niż 24h. Poniżej 24 to inkubacja.

1. Podstawowe zasady postępowania z tkankami i komórkami hodowanymi in vitro.

1. Wyposażenie pracowni:

A. „Laminar flow”

- komora z laminarnym przepływem sterylnego powietrza.

- powietrze przed wejściem do komory przechodzi przez sterylne filtry HEPA – niskocząsteczkowe (do 3µm)

Rodzaje komór:

a) z horyzontalnym przepływem powietrza wydmuchiwanym z komory i kierowanym na eksperymentatora

b) z wertykalnym przepływem powietrza

c) Biohazard – do pracy z materiałem zakaźnym, wyposażone w szklaną osłonę z otworem na ręce eksperymentatora

B. Inkubator CO2

- głównie do hodowli zwierzęcych

- umożliwia kontrolę środowiska hodowli: temperatury (37st większość linii hodowlanych), stężenia CO2 (5%), wilgotności

C. Łaźnia wodna (podgrzewana do temp. 37st)

* Sterylność w komorze:

- filtry mikrobiologiczne i laminarny przepływ powietrza

- dezynfekcja za pomocą 70% etanolu

- lampa UV

- okresowe sprawdzanie szczelności filtrów mikrobiologicznych poprzez ustawianie szalek z pożywkami mikrobiologicznymi

1.2. Zakładanie hodowli:

- w sterylnym pomieszczeniu/komorze

- przy użyciu wysterylizowanych narzędzi i szkła laboratoryjnego

- używanie antybiotyków

Odczynniki do hodowli:

- pozbawione zanieczyszczeń i sterylne, filtracja przez filtry mikrobiologiczne, sterylizacja w autoklawie (np. wody)

- przechowywane w warunkach nie zagrażających zakażeniu np. lodówka w pomieszczeniu do hodowli in vitro

Najczęściej stosowane pożywki:

* MEM

* DMEM

* F12

*RPMI 1640

* McCoy’s

* Fisher’s

*Ham’s F-10

pH: 7,2-7,4

Ogólny skład pożywek hodowlanych:

- węglowodany – jako główne źródło energii (glukoza, galaktoza)

- aminokwasy, peptydy, białka – podstawowy materiał budulcowy, spełniają funkcje transportowe i służą jako czynniki wzrostu

- sole nieorganiczne – jony tych soli pozwalają utrzymać odpowiednie ciśnienie osmotyczne i biorą udział w regulacji potencjału błonowego komórek

- witaminy – są prekursorami lub kofaktorami enzymów komórkowych, wiele witamin (gr B) ma istotne znaczenie dla wzrostu i proliferacji komórek utrzymywanych w hodowli in vitro. Najczęściej dodawane witaminy to ryboflawina, tiamina, biotyna.

- surowica – większość pożywek stosowanych do hodowli komórek wzbogacane jest 5-10% dodatkiem bydlęcej surowicy płodowej FBS, zawierającej czynniki i hormony stymulujące wzrost komórek, czynniki adhezyjne, białka nośnikowe wielu hormonów, sole mineralne, lipidy. Neutralizują one efekty toksyczne np. metali ciężkich, zapobiega zmianom środowiska (zmiana pH).

* Media komórkowe zawierają w swym składzie wskaźniki pH.

Najczęściej stosowana jest czerwień fenolowa.

Zmiana barwy pożywki w zależności od pH:

Purpurowa – 7,8

Pomarańczowa – 7,0

Czerwona – 7,4

Żółta – 6,5

1.3. Rodzaje kultur zwierzęcych in vitro:

1. hodowle pierwotne

2. hodowle w zawiesinie

3. hodowle narządowe

4. hodowle na mikronośnikach

5. hodowle przestrzenne

1. Hodowle pierwotne – wywodzą się z komórek wyizolowanych bezpośrednio z tkanek lub narządów. Ich wadą jest stosunkowo krótki czas przeżywalności komórek w hodowli.

Hodowle wtórne – hodowle ustalonych linii komórkowych i ciągłych linii komórkowych. Komórki z hodowli pierwotnej po pierwszym pasażu stają się hodowlami wtórnymi ustalonych linii komórkowych.

2. Hodowle w zawiesinie – hodowle komórek w specjalnych naczyniach z wbudowanym mieszadłem magnetycznym i wiosełkami poruszającymi zawiesiną komórek. Do hodowli stosuje się specjalne pożywki tzw. płyny spinerowe, które nie zawierają jonów Mg, Ca.

3. Hodowle narządowe – hodowle całych narządów lub fragmentów, struktura narządu nie jest naruszona, dzięki czemu wyniki są zbliżone do sytuacji in vivo.

4. Hodowle na mikronośnikach – hodowle komórek czepnych na kulkach dekstranowych, szklanych lub plastikowych. Duża objętość wzrostu w małej objętości pożywki.

5. Hodowle przestrzenne – hodowle, w których odtworzono wzajemne przestrzenne kontakty między komórkami oraz poszczególnymi typami komórek tkanki. Zaliczamy do nich np. hodowle narządowe.

Wzrost komórek adhezyjnych w hodowli in vitro przechodzi 3 fazy:

Faza lag – następuje po przeniesieniu zawiesiny komórek do nowego naczynia hodowlanego, w tej fazie komórki adaptują się do nowych warunków środowiska, odbudowują glikokaliks, przyczepiają się do dna naczynia hodowlanego. Ilość komórek nie zwiększa się, bo nie zachodzą jeszcze podziały komórek. Faza lag trwa od kilku do kilkunastu godzin w zależności od rodzaju linii komórkowej.

Faza log – charakteryzuje się intensywnymi podziałami komórkowymi, komórki znajdują się w logarytmicznej fazie wzrostu aż do całkowitego pokrycia dna naczynia hodowlanego, po czym ich podziały ustają w wyniku kontaktowego zahamowania wzrostu.

Faza stacjonarna – liczba komórek nie zwiększa się, pokrywają one całe dno naczynia (hodowla konfluentna). Następuje szybkie zużycie składników odżywczych podłoża oraz nagromadzenie toksycznych produktów przemiany materii.

* Pasażowanie hodowli:

Podczas pasażu komórki odklejone od dna naczynia hodowlanego rozcieńcza się w odpowiednim stosunku w świeżym podłożu i przenosi do nowych naczyń hodowlanych. Pasażowanie zapewnia ciągłość wzrostu linii komórkowej oraz powala na namnożenie puli komórek niezbędnych do badań.

1.4. Testy żywotności komórek

* Test kolorymetryczny – wykazuje zdolność dehydrogenaz mitochondrialnych do konwersji żółto zabarwionego substratu (sól tetrazolowa MTT) w purpurowy formazan.

n formazanu = n żywych komórek

Ilość formazanu wyznacza się spektrofotometrycznie.

* Test LDH

- Przekształcenie mleczanu do pirogronianu katalizowane przez dehydrogenazę mleczanową LDH.

- Redukcje tetrazoliny do formazanu katalizowane przez diaforazę – reakcja barwna.

* Barwienie oranżem akrydyny i bromkiem etydyny

- oranż akrydyny przechodzi przez błonę komórek – barwi całą komórkę, a bromek etydyny nie wchodzi przez nieuszkodzone błony komórek żywych.

* Wychwyt czerwieni obojętnej

- oparty jest na wbudowaniu czerwieni obojętnej (NR) do lizosomów żywych komórek poprzez bierny transport przez błonę komórkową

- uszkodzone lub martwe komórki nie mają tych właściwości

* Test Alamar – Blue

- zawiera indykator oksydoreduktazy

- proliferacja komórek indukuje chemiczną redukcję medium co powoduje zmianę koloru z niebieskiego na czerwony

- stopień proliferacji wykreślany jest intensywnością czerwonego koloru mierzoną spektrofotometrycznie

1.5. Potencjalne wykorzystanie hodowli in vitro:

Kultury zwierzęce:

- tworzenie modeli tkankowych do badań naukowych

- testowanie nowych leków

- hodowle tkanek i narządów do przeszczepów

- zapłodnienie in vitro

Korzyści z prowadzenia hodowli in vitro:

- kontrola warunków doświadczalnych i stosunkowa łatwość modyfikacji wskaźników mikrośrodowiska komórek

- prowadzenie całych cykli doświadczeń przy użyciu tego samego materiału biologicznego

- możliwość porównania wyników badań prowadzonych przez różne pracownie

- eksperymenty na komórkach in vitro są z reguły tańsze od doświadczeń na zwierzętach doświadczalnych

co to pasaz komorek , opisac faze wzrostu log , wymienic testy cytotoksycznosci 

asada metody MTT, po co stosowana jest 5-10% surowica bydlęca, jak zachować jałowość w komorze