Biotechnologia - prelekcja 2

ELISA – metoda ilościowa umożliwiająca wykrywanie peptydów, białek, przeciwciał, hormonów. Technika oparta na reakcji antygen – przeciwciało.

Test ELISA:

Podstawą działania tego testu jest wykorzystywanie antygenu lub przeciwciała związanego z podłożem stałym i kompleksu przeciwciała sprzężonego z enzymem (najczęściej peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna lub oksydaza glukozowa).

- test immunoenzymatyczny

- jeden z najpowszechniej stosowanych testów w badaniach biomedycznych, zarówno naukowych jak i diagnostycznych

- należy do grupy testów tzw. „fazy stałej”

- wywodzi się z testu RIA (Nagroda Nobla 1977)

Testy ELISA charakteryzują się:

- wysoką czułością

- swoistością

- powtarzalnością

- krótkim czasem wykonania

Typy testu ELISA:

- bezpośredni

- pośredni

- kanapkowy (om nom nom)

- konkurencyjny, kompetencyjny, rywalizacyjny

1. Bezpośredni test ELISA:

Pierwszym etapem testu jest związanie (opłaszczanie) antygenu. Następnie blokuje się miejsca niezajęte przez antygen. Kolejnym etapem jest inkubacja z roztworem przeciwciała specyficznym do badanego białka wyznakowanym odpowiednim enzymem (znakowanie przeciwciał). Po dodaniu substratu odpowiedniego dla danego enzymu pojawi się reakcja chemiczna, a jej intensywność świadczy o ilości badanego białka w próbie.

Zalety:

- krótka procedura

- wyeliminowane możliwe reakcje krzyżowe od II-rzędowych przeciwciał

Wady:

- konieczność posiadania swoistego przeciwciała (wyznakowanego)

- każdorazowe znakowanie przeciwciał jest czasochłonne i drogie

- przeciwciała stosowane nie są uniwersalne

- małe wzmocnienie sygnału

2. Pośredni test ELISA:

Pierwszym etapem testu jest związanie (opłaszczanie) antygenu na podłożu. Przeprowadza się to przez dodanie do studzienki roztworu opłaszczanej substancji i inkubację noc w 4stC. Następnie blokuje się miejsca niezajęte przez antygen za pomocą czynników blokujących np. roztworu owoalbuminy. Etap ten zapobiega nieselektywnemu przyłączaniu się badanych białek do fazy stałej podczas następnych etapów testu. Kolejnym krokiem jest inkubacja z roztworem przeciwciała specyficznym do badanego białka.

Przeciwciało po związaniu białka uwidacznia się poprzez dodanie II-rzędowego przeciwciała (skierowanego przeciwko globulinie zwierzęcia, z którego pochodzi przeciwciało I-rzędowe). Przeciwciało II-rzędowe związane jest z enzymem (najczęściej peroksydazą chrzanową lub fosfatazą alkaliczną). Po dodaniu substratu odpowiedniego dla danego enzymu pojawi się reakcja barwna, a jej intensywność świadczy o ilości badanego białka w próbie.

Zalety:

- nie ma konieczności znakowania specyficznych przeciwciał

- duża ilość komercyjnie dostępnych przeciwciał

- większa czułość – wzmocnienie sygnału

Wady:

- możliwość wystąpienia sygnałów niespecyficznych

- dłuższa procedura – dodatkowy etap inkubacji

3. Kanapkowy test ELISA:

Pierwszym etapem testu jest związanie (opłaszczanie) przeciwciał specyficznych do badanego białka na podłożu i blokuje się miejsca nie zajęte przez przeciwciała. Następnie płytkę inkubuje się z antygenem. Kolejnym etapem jest inkubacja z roztworem innego przeciwciała, również specyficznego do badanego białka związanego z odpowiednim enzymem. Po dodaniu substratu odpowiedniego dla danego enzymu, pojawia się reakcja barwna, a jej intensywność świadczy o ilości badanego białka w próbie.

4. Kompetencyjny test ELISA:

W kompetencyjnym (rywalizacyjnym) teście ELISA wykorzystuje się współzawodnictwo o miejsce wiązania na antygenie mieszaniny różnych przeciwciał. W schemacie doświadczenia wyróżnia się metodę pośrednią oraz bezpośrednią (z wykorzystywaniem wyznakowanych enzymem przeciwciał I-rzędowych).

Problemy:

- nieodpowiednie lub niewystarczające płukanie (niedokładność, wartości wyników zbyt wysokie lub niskie)

- postepowanie niezgodne z protokołem (czas inkubacji, temperatura, rozcieńczenia)

- pipety ( nieodpowiednie używanie, nieskalibrowane)

- kontaminacje (problemy z poszczególnymi etapami)

Zastosowanie:

- pomiar poziomu hormonów (hCG, LH), testy ciążowe

- wykrywanie infekcji wirusowych (HIV, WZW B (HBV), WZW C (HCV))

- detekcja alergenów w pożywieniu

- detekcja narkotyków (kokaina