Biotechnologia, prelekcja 3.

IMMUNODETEKCJA BIAŁEK

Wykorzystywanie przeciwciał mono- i poliklonalnych:

- Western blotting

- Immunocytochemia

- Immunoprecypitacja

- ELISA

- Cytometria przepływowa

WESTERN BLOTTING

- metoda stosowana do detekcji białka w próbie zawierającej wiele biomolekuł przy zastosowaniu przeciwciał (jako sond), wykazujących wysoką specyficzność dla danego białka

- etapy stadia hybrydyzacji western blotting:

• Rozdział białek przy wykorzystaniu elektroforezy SDS-PAGE.

• Transfer białek z żelu na membranę.

• Inkubacja membrany ze specyficznymi przeciwciałami.

• Detekcja białek na membranie.

1. Aby rozdzielić białko na podstawie różnic w ciężarze cząsteczki, przeprowadza się elektroforezę:

1. W żelu poliakrylamidowym

2. W warunkach denaturujących

- SDS (siarczan dodecylu sodu)- silny detergent, przyłącza się do obszarów hydrofobowych cząsteczki białka i powoduje jej „rozkręcanie” do struktury łańcucha polipeptydowego. Umożliwia migrację białka do polu elektrycznym w kierunku dodatniej elektrody.

- B- merkaptoetanol- przecina mostki S-S między białkami, ma silne właściwości redukujące.

Elektroforeza nieciągła:

- żel zagęszczający: 4-5% akrylamid, pH= 6,8

- żel rozdzielający (separujący): 8-14% akrylamid, pH= 8,8

Barwienia białek w żelu:

- coomasie blue

- srebro

- barwienie fluorescencyjne

1. Transfer białek z żelu na membranę.

Typy membran:

- nitroceluloza (azotan celulozy)- tania, ale krucha

- aktywowany nylon (PVDF)- bardzo dobra wytrzymałość mechaniczna, umożliwia wiązanie dużej ilości białek

Metody transferu:

- dyfuzja

- transfer w warunkach próżniowych

- elektrotransfer (mokry, półsuchy)- najczęściej stosowany, duża szybkość transferu

Barwienie białek na membranie:

- roztwór Ponceau S

- szybkie (5 min) barwienie białka na membranie nitrocelulozowej lub PVDF

- barwienie jest odwracalne przez płukanie membrany w wodzie lub 0,1M NaOH przez 1 min

1. Blokowanie wiązania niespecyficznego

Roztwory blokujące:

- 3-10% BSA

- 1-5% odtłuszczone mleko w proszku rozpuszczone w TRIS lub PBS

- inkubacja 30 min w 37°C lub 4°C przez całą noc

1. Metody wykrywania przeciwciał

1. Przeciwciało znakowanie radioizotopami:

- powszechnie stosowane radioizotopy: ³H, ¹⁴C, ³²P, ¹²⁵J

- emitują promieniowanie α, β lub γ, które może być wykrywane przez liczniki scyntylacyjne lub autoradiografię

1. Przeciwciało znakowane fluorochromami:

- mała fluorescencyjna molekuła (fluor ochrom) kowalencyjnie związana, absorbująca światło przy jednej długości fali, a emitująca światło przy innej długości fali

1. Przeciwciała znakowane enzymami

- peroksydaza chrzanowa: Substraty:

• diaminobenzydyna (DAB)- produkt brązowy

• 4-chloro-1-naftol- produkt niebieski

- fosfataza alkaliczna: Substraty:

• fosforan naftolu AS-MX- produkt niebieski

• fosforan naftolu AS-TR- produkt czerwony

PODSUMOWANIE:

- metoda Western Blotting może być użytecznym narzędziem do analizy ekspresji białka

- metoda Western Blotting może być medycznym narzędziem diagnostycznym (HIV, choroba wściekłych krów, borelioza)