Enzymy restrykcyjne to endonukleazy restrykcyjne, rozpoznaja specyficzna sekwencjue w obrebie dwuniciowego DNA i wiaza się w jej obrebie, hydroliza obu nici DNA w oibrebie sekwencji rozpoznawanej lub pewnej odleglosci (wewnetrzen wiązania fosfodiestrowe)

Naturalnie występują u bakterii i sinic, są elementami systemu obronnego restrykcji-metylacji (ochrona przed obcym fagowym DNA): wielojednostkowy enzym o aktywności endonukleolitycznej i metylacyjnej, gdy jedna z nici jest zmetylowana metylaza modyfikuje drugą nić (niezmetylowaną), obie nici niezmodyfikowane hydroliza DNA przez endonukleazę

Nazewnictwo: I enzym wyizolowany z Bacillus stearothermophilus B225 : Bst(3 literowy skrót nazwy bakterii, 1 litrera rodzaj, 2 i 3 gatunek)B(nazwa szczepu)I (kolejny enzym wyizolowany z danego szczepu lub serotypu) ; BstBI

Klasy restryktaz: podział uwzglednia: mechanizm działania, skład podjednostek, substraty,produkty, kofaktory

Endonukleazy klasy I: specyficzne rozpoznawanie sekwencji, niespecyficzne cięcie (odległość do 1000 pz) , mają 3 typy podjednostek, które mają i aktywność nukleazy i metylazy, potrzebują aż 3 kofaktorów : ATP, Mg2+, SAM

Endonukleazy klasy III: odgległość sekwencji rozpoznanej od sekwencji przecinanej wynosi średnio 25 pz, składają się z 2 podjednostek, potrzebuje kofaktorów: ATP, Mg2+ i niekoniecznie SAM

Enzymy klasy II: rozpoznają sekwencje palindromowe(czytane od 5’ do 3’ i od 3’ do 5’ mają taką samą sekwencję) o długości 4,6 lub 8 pz, hydroliza powoduje wytworzenie ściśle określonych końców, kofaktorem jest tylko Mg2+, rożnią się od metylaz występujących w obrebie tej samej grupy- metylazy są kodowane przez odrębne geny, ale rozpoznają i modyfikują te same sekwencje, co restryktazy, maja bezpośrednie zastosowanie w biologii molekularnej

Sposoby hydrolizy- tępe końce: dwuniciowe nacięcie wzdłuż jednej osi symetrii , po cięciu mamy jedną oś, żadne nukleotydy nie odstają

lepkie końce: cięcie w różnych miejscach- podwójna oś symterii,ułatwiają ligację fragmentów DNA (powstają dwa komplementarne względem siebie, jednoniciowe konce , zdolne do odtworzenia struktury dwuniciowej przydatne do klonowania molekularnego)

Izoschizomery: są to enzymy restrykcyjne, pochodzące z roznych zrodel, rozpoznające taka samą sekwencję, izoschizomery mogą roznic się miedzy sobą miejscem trawienia czy wrazliwością na metylację czy wydajnością trawienia w roznych miejscach

Warunki dla działania restryktaz: pH 7,2-7,6 ( Triss- HCl z buforu) , siła jonowa buforu (NaCl lub KCl), kofaktory (zawsze Mg2+), stabilizatory (BSA, DTT, 2-merkaptoetanol), temperatura (zwykle 37 stopni, obecne wyjątki), wrażliwośc, niewrażliwość na metylację

Star activity: zjawisko obizenia specyficzności rozpoznawania sekwencji w wyniku nieprawidłowego dobrania warunków reakcji- w rezultacie nastepuje hydroliza sekwencji rozniacych się od właściwych o jeden lub więcej nukleotydow

Jednostka aktywności: ilość enzymu, która jest konieczna do pełnej hydrolizy jednego mikrograma DNA wzorcowego w ciągu jednej godziny w optymalnych warunkach, jednostką jest 1U

Wykorzystanie restryktaz: analiza mutacji i polimorfizmów , medycyna sądowa( do identyfikacji i ustalania pokrewieństwa), do klonowania molekularnego( działaniu tych samych restryktaz poddaje się DNA oraz wektor), konstrukcja map restrykcyjnych (schematow DNA z uwzględnieniem miejsc rozpoznawanych przez dane enzymy restrykcyjne oraz odległosciami miedzy nimi

PCR-RFLP( restriction fragments lenght polymorphism): polimorfizm dlugosci fragmentow restrykcyjnych, jest uwarunkowany roznicoami w sekwencji nukleotydow, mutacje powodują powstanie nowego lub likwidację istniejącego miejsca rozpoznawanego przez dany enzym restrykcyjny np. gen RYR-1 , warunkujący podatność świń na stres

Po trawieniu DNA restryktazami otrzymuje się fragmenty, które po rozdziale w żelu tworzą charakterystyczny wzór prążkowy. Polimorfizm w miejscu wiązania enzymu restrykcyjnego powoduje, ze utworzony zostanie odmienny wzor prążkowy ni8z w przypadku fragmentu bez polimorfizmu. Mozliwe są 3 wzory prążkowe, dla jednej homozygoty, heterozygoty i drugiej homozygoty.

Przebieg ćwiczenia: PCR, inkubacja z enzymem restrykcyjnym, długość sekwencji zamplifikowanej w reakcji PCR: 659 pz