1. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z metodą oznaczania grup sulfhydrylowych w białkach oraz z techniką oznaczania tych grup za pomocą odczynnika Ellmana.

Oznaczenie ilości grup sulfhydrylowych aldolazy A wraz z określeniem stopnia ich ekspozycji do rozpuszczalnika roztworu. Określenie ilości grup SH tzw. „dostępnych” i „niedostępnych” dla odczynnika Ellmana. Oznaczenie „wszystkich” grup SH po uprzednim rozfałdowaniu białka czynnikiem denaturującym.

1. Wstęp teoretyczny

Cysteina jest aminokwasem występującym powszechnie w cząsteczkach białkowych.
W aminokwasie tym występują reszty cysteinylowe związane w mostki disiarczkowe.
Reszty te nadają cząsteczce białka szczególne właściwości wynikające z ich specyficznych cech fizyko-chemicznych. Aby móc wyznaczyć wolną ilość reszt cysteinylowych należy cząsteczkę białka poddać wstępnej denaturacji chemicznej ( np. przy udziale 6 M roztworu chlorowodorku guanidyny lub 8 M roztworu mocznika), a następnie przeprowadzić reakcję z udziałem odczynnika Ellmana. Do wyznaczania liczby tioli w cząsteczkach białkowych stosowane są głównie dwie techniki: elektroforetyczna i spektroskopowa.
W przypadku tej drugiej, do obliczeń stosuje się prawo Lamberta-Beera.

1. Materiały

• Odczynniki

• Bufor ( 10mM Tris-HCl, 2mM EDTA ) o pH 7.5

• 4% roztwór siarczanu dodecylu sodu ( SDS ) w buforze (10mM Tris-HCl, 2mM EDTA) o pH 7.5

• 10mM roztwór soli potasowej kwasu 5,5’-ditiobis-2-nitrobenzoesowego (DTNB) w buforze (10mM Tris-HCl, 2mM EDTA) o pH 7.5

• Roztwór aldolazy A w buforze (10mM Tris-HCl, 2mM EDTA) o pH 7.5

• Szkoło i aparatura

• Probówki chemiczne

• Parafilm

• Pipety automatyczne oraz tipsy

• Kuwety

• Spektrofotometr

1. Przebieg ćwiczenia

1. Spektrofotometryczne oznaczenie białka

• Do probówki dodajemy 2ml buforu (10mM Tris-HCl, 2mM EDTA) o pH 7.5 a następnie zerujemy spektrofotometr przy długości fali 280 nm wobec buforu w probówce użytego jako odnośnik

• Do opróżnionej i wysuszonej kuwety wlewamy 2ml wyjściowego roztworu białka aldolazy A

• Mierzymy absorbancję przy długości fali 280nm

$${\frac{0,856}{0,4} = 2,14\backslash n}{\frac{4,5}{2,14} = 2,10\backslash n}$$

Do pomiarów bierzemy 2ml roztworu wyjściowego białka i 2,5ml buforu

R=$\frac{4,5}{2,00} = 2,25$

• Zerujemy spektrofotometr, napełniamy kuwetę 2ml rozcieńczonego roztworu białka i mierzymy absorbancję przy długości fali 280nm

1. Oznaczanie „wszystkich” grup SH w białku

• W probówce rozcieńczamy dwukrotnie roztwór ((10mM Tris-HCl, 2mM EDTA o pH 7.5 + 4% SDS ) za pomocą roztworu (10mM Tris-HCl, 2mM EDTA) o pH 7.5 do końcowej objętości równej 9ml ( R=2 dodajemy 4,5ml buforu i 4,5 ml buforu z SDS )

• Odnośnik stanowią 2ml rozcieńczonego roztworu białka

• Próbką jest 1ml rozcieńczonego roztworu białka i 1ml wyjściowego roztworu (10mM Tris-HCl, 2mM EDTA o pH 7.5 + 4%SDS )

• Po wymieszaniu roztworów, do wszystkich probówek dodajemy sól potasową kwasu 5,5’-ditiobis-2-nitrobenzoesowego (DTNB) w buforze (10mM Tris-HCl, 2mM EDTA) o pH 7.5 w objętości 0,1ml co skutkuje 20-krotnym rozcieńczeniem roztworu.
  2ml+x=20x
  2ml=19x
  x=0,1ml

• Inkubujemy próbki w temperaturze pokojowej przez 15min

• Mierzymy absorbancję badanej próbki przy długości fali 412nm po wcześniejszym wyzerowaniu spektrofotometru względem odnośnika.

1. Oznaczanie „dostępnych” grup SH w białku

• Odnośnikiem są 2ml roztworu (10mM Tris-HCl, 2mM EDTA) o pH 7.5

• Do 2 probówek podpisanych „próbka” dodajemy po 1ml rozcieńczonego roztworu białka oraz po 1ml roztworu (10mM Tris-HCl, 2mM EDTA) o pH 7.5

• Po wymieszaniu roztworów, do wszystkich probówek dodajemy sól potasową kwasu 5,5’-ditiobis-2-nitrobenzoesowego (DTNB) w buforze (10mM Tris-HCl, 2mM EDTA) o pH 7.5 w objętości 0,1ml dzięki czemu otrzymamy 20-krotne rozcieńczenie roztworu.
  2ml+x=20x
  2ml=19x
  x=0,1ml

• Próbki inkubujemy w temperaturze pokojowej przez 15min

• Zmierzyliśmy absorbancję badanej próbki przy długości fali 412nm wcześniej zerując spektrofotometr względem odnośnika.

1. Wyniki i obliczenia

1. Spektrofotometryczne oznaczenie białka

A280^0	R	A280^R	C280^R [mg/ml]	C280^R [M]
0,856	2,25	0,388	0,426	2,66*10^-6

1. Oznaczanie „wszystkich” grup SH w białku

I pomiar A412	II pomiar A412	A412^sr	Błąd [%]	CTNB− [M]	CSH^t	Cald^M	$$\frac{C_{\text{SH}}^{t}}{C_{\text{ald}}^{M}}$$
0,549	0,559	0,554	1,81	4,07*10^-5	4,07*10^-5	1,27*10^-6	32

1. Oznaczanie „dostępnych” grup SH w białku

I pomiar A412	II pomiar A412	A412^sr	Błąd [%]	CTNB− [M]	CSH^dost.	Cald^M	$$\frac{C_{\text{SH}}^{\text{dost.}}}{C_{\text{ald}}^{M}}$$
0,140	0,147	0,1435	4,88	1,06*10^-5	1,06*10^-5	1,27*10^-6	8

• Obliczenie stężenia masowego i molowego rozcieńczonego roztworu białka C₂₈₀^R

Prawo Lamberta-Beera

A=C*E*I

A-absorbancja

C- stężenie substancji rozpraszającej w roztworze

E-współczynnik ekstynkcji substancji rozpraszającej w roztworze

I-droga jaką pokonuje światło w roztworze

Dane:

Masowy współczynnik ekstynkcji aldolazy ( zmierzony przy długości fali 280nm dla 0,1% roztworu aldolazy z mięśni królika, I=1cm): E₂₈₀^0, 1%=0,91ml/(mg*cm)

I=1cm

Masa molowa aldolazy A: M_ald=160kDa

C=$\frac{A}{E*I}$= $\frac{0,388}{0,91*1} = 0,426\lbrack\frac{\text{mg}}{\text{ml}}\rbrack$= 2,66*10^-6 [M]

• Obliczenie stężenia molowego aldolazy w mieszaninie reakcyjnej C_ald^M ∖ n

C_ald^R*V_ald^R=C_ald^M*V_ald^M ∖ nC_ald^M=$\frac{C_{\text{ald}}^{R}*V_{\text{ald}}^{R}}{V_{\text{ald}}^{M}}$=$\frac{2,66*10^{- 6}*1}{2,1}$=1,27*10^-6 [M]

• Obliczenie molowego stężenia anionu nitromerkaptobenzoesowego w badanych roztworach.

ε-molowy współczynnik ekstynkcji przy długości fali 412nm = 13600[1/(mol*cm)

C_TNB^-=$\frac{A}{\varepsilon*I}$= $\frac{0,554}{13600*1}$=4,07*10^-5 [M]

C_TNB^-= C_SH^t=4,07*10^-5 [M] („wszystkie” grupy tiolowe w białku)

• Obliczenie stosunku molowego „wszystkich” grup tiolowych w białku do aldolazy w mieszaninie reakcyjnej.

$\frac{C_{\text{SH}}^{t}}{C_{\text{ald}}^{M}} = \frac{4,07*10^{- 5}\ }{1,27*10^{- 6}}$=32,05=32

• Obliczenie stosunku molowego „dostępnych” grup tiolowych w Białki do aldolazy w mieszaninie reakcyjnej

$\frac{C_{\text{SH}}^{\text{dost.}}}{C_{\text{ald}}^{M}} = \frac{1,06*10^{- 5}}{1,27*10^{- 6}}$= 8

• Obliczenie ilości „niedostępnych grup SH a aldolazie

„niedostępne” grupy SH= „wszystkie” grupy SH- „dostępne” grupy SH

„niedostępne” grupy SH=32-8=24

1. Wnioski

Wykonanie poszczególnych pomiarów i obliczeń pozwala nam określić ilość grup sulfhydrylowych w aldolazie A oraz stopień ich wyeksponowania do rozpuszczalnika. W każdym z ćwiczeń sporządzone zostały próbki odnośnikowe, które stanowiły wzorzec i punkt odniesienia dla otrzymanych wyników.

Na podstawie wyznaczonego stosunku molowego grup tiolowych do aldolazy określiliśmy ilość reszt cysteinylowych przypadających na jedną cząsteczkę białka (32 reszty). Zgodnie z danymi literaturowymi, w króliczej aldolazie znajduje się 28 reszt przypadających na jedną cząsteczkę białka, więc otrzymany wynik można uznać za prawdopodobny, a dokładność wykonania doświadczenia ocenić jako dobrą.

Całkowitą ilość grup SH oznaczamy po rozfałdowaniu białka czynnikiem denaturującym, ponieważ tylko w taki sposób można wyeksponować wszystkie grupy, nawet te, które w normalnych warunkach są niedostępne. Czynnik denaturujący rozcina jedynie mostki disiarczkowe, nie modyfikując przy tym innych grup funkcyjnych występujących w białku.