Metody uzyskiwania preparatów chromosomowych
Sporządzanie preparatów z komórek szpiku kostnego (wg Tjio & Whang, 1962)
Procedura:
1. Pozyskiwanie materiału:
- wyizolowanie z tuszki kości udowej
- oczyszczenie kości i odcięcie ½ końca bliższego kości
- wypłukiwanie z trzonu kości szpiku kostnego [sterylną strzykawką z zawartością 10 ml ogrzanego do temperatury 37oC roztworu PBS, z dodatkiem 0,1% C22H25O6N]
- wirowanie materiału przez 8 minut przy 1500 rpm (obrotów/minutę)
- odciągnięcie supernatantu znad osadu komórek
2. Hipotonizacja komórek:
- dodanie roztworu hipotonicznego [10 ml 0,075 M KCl] o temperaturze 37oC
- inkubacja materiału w temperaturze 37oC przez 25 minut (20 min-1h)
3. Utrwalenie uzyskanego materiału:
- umieszczenie probówek z zawiesiną komórkową na lodzie na 1 minutę
- dodanie 1 kropli utrwalacza Carnoy’a (mieszanina metanolu i lodowatego kwasu octowego, zmieszanych w stosunku 3:1)
/Utrwalacz należy przygotować na świeżo i schłodzić na min. 2 godziny przed zastosowaniem w temperaturze 2-8oC/
- ponowne umieszczenie probówek z zawiesiną komórkową na lodzie na 1 minutę
- dodanie 2 kropli utrwalacza Carnoy`a do osadu
- umieszczenie probówek z zawiesiną komórkową na lodzie na 1 minutę
- dodanie 3 kropli utrwalacza Carnoy`a do zawiesiny
- ponowne umieszczenie probówek z zawiesiną komórkową na lodzie na 1 minutę
- wirowanie przez 5 minut przy 1500 rpm (obrotów/minutę)
- odciągnięcie supernatantu znad osadu komórkowego
- dodanie 5 ml utrwalacza Carnoy`a
- wirowanie przez 5 minut przy 1500 rpm (obrotów/minutę)
/Płukanie w utrwalaczu Carnoy`a powtarza się 5x/
4. Wykonanie preparatów:
- naniesienie 3-5 kropli otrzymanej zawiesiny na odtłuszczone szkiełka podstawowe w środowisku pary wodnej
- suszenie preparatów w temperaturze pokojowej
5. Wstępna ocena i wybór najlepszych preparatów przeznaczonych do barwienia prążkowego:
- analiza mikroskopowa
- kryterium oceny: obecność min. 5 metafaz na preparacie/wyraźne rozproszenie poszczególnych chromosomów w pojedynczej płytce metafazowej/brak artefaktów