Pestycydy – Metody oznaczanie

Oznaczanie pestycydów w próbkach środowiskowych wykonuje się najczęściej z wykorzystaniem metod:

1. Metody chromatograficzne:

- chromatografii gazowej (GC);

- wysokosprawnej chromatografia cieczowa (HPLC);

- chromatografii z płynem w stanie nadkrytycznym (SFC);

- chromatografii cienkowarstwowej (TLC)

1. Analiza spektralna

-spektrofotometria w świetle widzialnym

3. Zastosowanie wskaźników izotopowych

4.Metody enzymatyczne

5. Metody immunologiczne

- testy immunologiczne.

6. Metody selekcji

1. Metody chromatograficzne:

Chromatografia gazowa (GC)

Do oznaczania pestycydów i najczęściej stosuje się kapilarną chromatografię

gazową w połączeniu z odpowiednim detektorem, specyficznym dla danej grupy związków.

W chromatografii gazowej fazę nieruchomą stanowi zazwyczaj ciecz osadzona na obojętnym ciele stałym, podczas gdy fazą ruchomą jest gaz obojętny (np. azot lub argon).

Zakres stosowalności GC jest określony głównie trwałością termiczną próbki

i materiałów chromatograficznych. Próbka do analizy z wykorzystaniem tej techniki musi

być termicznie trwała w temperaturze niezbędnej do odparowania oznaczanych składników.

Warunki pracy chromatografu dobiera się w zależności od właściwości analizowanej

grupy związków. Dozowanie próbki, które zależy również od właściwości analizowanej

grupy związków, a także od ich zawartości w ekstrakcie, można prowadzić, stosując

dozownik „z” lub „bez” dzielenia strumienia gazu nośnego (split/splitless) albo dozownik

z bezpośrednim dozowaniem do zimnej kolumny chromatograficznej (cold

on-column). Przy wyborze detektora należy zwrócić uwagę na zakres stężeń analitów

w próbce, skład matrycy i ewentualną konieczność odzyskania analitu na wylocie

z kolumny.

Stosowanie chromatografii gazowej wymaga jednak dokładnego oczyszczenia ekstraktów, gdyż w przeciwnym razie mogą wystąpić zakłócenia w pracy detektora; nie można również zapominać, że w wysokich temperaturach potrzebnych często do uzyskania wystarczającego rozkładu zachodzi rozkład niektórych pestycydów, co może rzutować na jakość uzyskanych wyników.

wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)

Wysokosprawna chromatografia cieczowa ma również szerokie zastosowanie na etapie oznaczania pestycydów, a w szczególności charakteryzujących się niską lotnością lub termicznie nietrwałych. Kolumny chromatograficzne wykorzystywane w HPLC mają większe rozmiary niż w GC i są wypełnione fazą stacjonarną. Fazą ruchomą jest rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników, natomiast dobór fazy stacjonarnej jest uwarunkowany zapewnieniem odpowiedniego oddziaływania pomiędzy fazą stacjonarną a oznaczanymi składnikami próbki. Dobór detektora, a tym samym czułość metody, zależy od ilości próbki, jaką się dysponuje. Przy małych objętościach dozowanych próbek ekstraktów, o małym stężeniu analitu, wykorzystuje się detektory o dużej czułości.

chromatografii z płynem w stanie nadkrytycznym (SFC)

Połączeniem technik GC i HPLC jest chromatografia z fazą ruchomą w stanie nadkrytycznym, której przewagą nad wcześniej omówionymi technikami jest uniwersalność

w rozdzielaniu związków przez dodatek modyfikatorów i wybór fazy stacjonarnej,

a także możliwość stosowania różnych detektorów. Chromatografia z fazą ruchomą

w stanie nadkrytycznym pozwala na szybkie rozdzielenie substancji o dużej rozpiętości

temperatur wrzenia czy nawet nielotnych podczas jednej analizy. Jednak pomimo wielu

zalet jest to technika dość rzadko wykorzystywana ze względu na problemy natury technicznej oraz wysoki koszt niezbędnej aparatury, znacznie przewyższający koszt oprzyrządowania niezbędnego w przypadku technik konkurencyjnych, takich jak chromatografia gazowa i cieczowa.

chromatografii cienkowarstwowej (TLC)

W chromatografii cienkowarstwowej fazą nieruchomą jest aktywne ciało stałe przylegające do płytki szklanej lub paska, fazę ruchomą – stanowi rozpuszczalnik organiczny lub jego mieszanina z wodą. Zaletą tej metody jest to, że warstwa absorbenta może przyjąć stosunkowo duże ilości ekstraktu. Zdolność ta pozwala na zastosowanie chromatografii cienkowarstwowej dla celów oczyszczania prób przeznaczonych do pomiarów za pomocą chromatografii gazowej lub dla celów analizy w podczerwieni.

1. Analiza spektralna

Metoda spektrofotometryczna

Jest to chemiczno – kolorymetryczna metoda analizy polegająca na przeprowadzeniu znajdującej się w roztworze badanej substancji za pomocą odpowiedniego odczynnika w związek o określonym zabarwieniu, którego ekstynkcja jest bezpośrednio zależna od stężenia oznaczanej substancji. Kolorymetria wizualna polega na ilościowym pomiarze absorpcji światła w badanym roztworze przez porównanie z zabarwionym standardem. Przy stosowaniu metod kolorymetrycznych największą trudność sprawia odpowiedni sposób oczyszczenia ekstraktów badanych prób. Niewłaściwe ich oczyszczenie może być przyczyną błędów spowodowanych wywołaniem niecałkowitego lub niewłaściwego zabarwienia ekstraktu, jego zmętnieniem, bądź nietrwałością koloru. W toku oczyszczania mogą również następować nadmierne straty pestycydu.

1. Zastosowanie wskaźników izotopowych

Wskaźniki izotopowe stosuje się do badania metabolizmu pestycydów. Badania te umożliwiają:

1. Ustalenie związku pomiędzy okresem toksycznego działania a szybkością i sposobem, w jaki pestycyd ulega przemianie,

2. Zbadanie szybkości wydalania pestycydów z organizmu ssaków,

3. Oszacowanie szybkości metabolizmu, miejsc odkładania się i charakteru produktów metabolicznych w roślinach, zwierzętach i glebie,

4. Zbadanie wzrostu lub spadku pierwotnej toksyczności po przemianie pestycydu w różne metabolity.

Dotychczas najbardziej powszechna metoda w badaniu metabolizmu pestycydów z zastosowaniem wskaźnika izotopowego polega na znakowaniu samego związku toksycznego. Procedura ta daje w rezultacie szybką i czułą metodę wykrywania pestycydu umożliwiając zbilansowanie znakowanych pozostałości, rozproszonych na skutek strat fizycznych oraz przemian chemicznych. Związki znakowane pierwiastkiem promieniotwórczym są również przydatne do oceny pozostałości wówczas, gdy nie dysponuje się innymi metodami lub gdy trzeba równocześnie oznaczyć szereg metabolitów.

1. Metody enzymatyczne

Enzymatyczne metody analizy pestycydów opierają się głównie na ocenie procesu hamowania aktywności cholinoesterazy. W zależności od zastosowanego sposobu oceny aktywności cholinoesterazy (a tym samym działania inhibitorów) można mówić o metodach:

- potencjometrycznej,

- miareczkowej,

- kolorymetrycznej,

-manometrycznej.

Podstawową zaletą metod polegających na ocenie procesu hamowania cholinoesterazy jest ich prostota, a główną wadą brak specyficzności.

1. Metody immunologiczne

Długi czas potrzebny na klasyczne przygotowanie próbek do współczesnych metod

instrumentalnych wskazywał na potrzebę rozwoju szybkich, łatwych w stosowaniu,

czułych i tanich metod, które mogłyby być stosowane in situ w warunkach polowych.

Możliwości takie stworzyła analiza immunologiczna, polegająca na wykorzystaniu

zdolności określonych cząstek biologicznych, zwanych przeciwciałami, do

selektywnego i odwracalnego wiązania molekuł organicznych - antygenów, które stanowią

anality zawarte w badanym obiekcie materialnym. W przypadku zastosowania analizy

immunologicznej do analizy żywności, w której oznacza się pestycydy, wykorzystuje

się zwykle wiązanie w trybie konkurencyjnym. W trybie tym do miejsc wiązania odpowiedniego przeciwciała konkuruje analit i znana ilość znakowanej postaci analitu zwana

koniugatem. Obecność nieoznakowanego analitu zmniejsza ilość miejsc wiązania dla

analitu oznakowanego, który następnie się oznacza.

Znacznikiem (markerem) umożliwiającym ilościowe oznaczenie liczby miejsc zajętych przez koniugat analit-marker najczęściej jest enzym, a stosowaną metodą jest metoda immunoenzymatyczna, znana jako test ELISA.

Ogólna zasada immunoanalizy przy oznaczaniu pestycydów jest następująca:

w pierwszym etapie pestycyd w próbce konkuruje z koniugatem pestycydu do ograniczonej liczby miejsc wiązania przez odpowiednie przeciwciało, które może być unieruchomione, np. na ściance płytki.

Obecność nieoznakowanego pestycydu w próbce powoduje, że mniejsza ilość pestycydu oznakowanego zostaje związana z przeciwciałem. Następnie wymywa się resztki niezwiązanego pestycydu i koniugatu. Ostatnim etapem analizy jest oznaczenie ilości związanego pestycydu na podstawie aktywności enzymu. Wynikiem reakcji może być np. zmiana koloru roztworu. Metody immunologiczne w analizie pestycydów służą przede wszystkim analizowaniu wody, pojawiają się już jednak doniesienia dotyczące możliwości ich wykorzystania w analizie próbek żywności.

1. Metody selekcji (screening)

Metody selekcji (segregacji) prób badanych są stosowane w wielu placówkach kontrolnych oraz przez producentów pestycydów. Wybór odpowiednich metod selekcji zależy w dużym stopniu od rodzaju pestycydów, jak również od wyposażenia laboratorium i kwalifikacji personelu.

Wśród metod selekcji najbardziej popularna jest technika zwana testem biologicznym.

Test biologiczny

Badania biologiczne, które przeprowadza się zwykle z formami użytkowymi pestycydów, maja na celu dokonanie oceny ich skuteczności, fitotoksyczności i toksyczności dla ssaków.

Skuteczność

Dla każdego nowo wprowadzonego pestycydu zaleca się przeprowadzenie okresowych badań jego aktywności. Niezbędne jest więc ustalenie dla każdego produktu i formy użytkowej odpowiedniej techniki i organizmu testowego. W przypadku insektycydów testy zazwyczaj przeprowadza się w warunkach laboratoryjnych na muchach, karaczanach, przędziorkach lub mszycach. Dla fungicydów można na ogół stosować jedną z metod testu laboratoryjnego na płytce agarowej. Dla herbicydów – uprawia się w szklarni odpowiednie rośliny testowe. W każdym przypadku badane próbki należy porównywać ze standardem o znanej aktywności.

Fitotoksyczność

Zazwyczaj badanie fitotoksyczności określonej formy użytkowej przeprowadza się w warunkach szklarniowych stosując odpowiednio wrażliwą roślinę testową. Podobnie jak w przypadku badań skuteczności – również i tutaj należy zawsze stosować standardy porównawcze. W badaniach tych zaleca się równoległe porównywanie próbek z ich standardami w zakresie różnych poziomów dawkowania.

Toksyczność

Dla sprawdzenia toksyczności dla ssaków danego pestycydu nie jest konieczne oznaczanie wielkości LD₅₀. Dawkę selekcyjną można ustalić z prawdopodobieństwem 95% wówczas, gdy spowoduje ona śmierć jednego lub dwóch zwierząt z ogólnej liczby 5 testowanych.

Ponownie sprawdza się tylko te próbki, które zabijają więcej niż 2 zwierząt spośród 5 i w miarę potrzeby oznacza aktualną LD₅₀. Precyzję i wiarygodność tej metody można zwiększyć używając do każdego badania 8 – 10 zwierząt testowych. Gatunkiem najczęściej używanym do określania dawek dootrzewnowych jest biały szczur, a dla ustalenia dawek naskórnych – królik.

Literatura:

1. Praca zbiorowa pod redakcją White-Stevensa R. „Pestycydy w środowisku.” Państwowe Wydawnictwo Rolnicze i Leśne, Warszawa 1977.

2. Beyer A. i Biziuk M. „Przegląd metod oznaczania pozostałości pestycydów i polichlorowanych bifenyli w próbkach żywności.” [w:] „Ecological Chemistry and Engineering” T. 14, Nr S3, 2007.

3. Kosikowska M. i Biziuk M. „Przegląd metod oznaczania pozostałości pestycydów w próbkach powietrza.” [w:] „Ecological Chemistry and Engineering” Vol. 16, No. S2, 2009.

4. Sadowska-Rociek A. i Cieślik E. „Stosowane techniki i najnowsze trendy w oznaczaniu pozostałości pestycydów w żywności metodą chromatografii gazowej.” [w:] „Chemia•Dydaktyka•Ekologia•Meteorologia” R. 13, Nr 1-2, 2008.