GRUPA A

1. enzymy restrykcyjne rozpoznają sekwencje palindormowe (4-8nukleotydowe)
2. Forma OC DNA powstaje w wyniku defragmentacji.
3. Forma CCC migruje w żelu agarozowym szybciej niż forma OC
4. Podczas rozdziału DNA w żelu agarozowym RNA jest widoczny w postaci w postaci smugi migrującej przed błekitem bromofenolowym
5. Ekstrakcja fenolowa służy do izolowania DNA (Stosuje się go w usuwaniu frakcji komórkowej, po dezintegracji ściany komórkowej)
6. Wirowanie w gradiencie gęstości CsCl pozwala na rozdzielenie cząsteczek DNA różniące się składem zasad
7. Aby zapobiec degradacji DNA przez endonukleazy podczas izolacji DNA do buforów dodaje się czynnik .. np. EDTA, który wiąże jony metali dwuwartościowych (Mg2+, Ca2+ itp.), które są kofaktorami enzymów nukleolitycznych
8. Kwasy nukleinowe wytrąca się za pomocą etanolu lub izopropanolu w obecności octanu potasu , sodu lub amonu albo chlorku wapnia
9. Polilinker to niewielki, sztucznie utworzony odcinek DNA, zawierający charakterystyczne sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne.

10. Na skalę preparatywną używa się DNA w ilości maks > 1 ug – 10 ug
11. Stosunek absorb A260/A280= 2,0 świadczy o obecności RNA?, czystości materiału genetycznego
12. Czysty preparat DNA powinien wykazywać stos absor A260/A280 – 1,8-2,0
13. „star activity” polega na obniżeniu lub na częściowym zaniku specyficzności enzymu co objawia się cięciem DNA w miejscach innych niż restrykcyjne.
14. W jaki sposób można określić wielkość plazmidu po izolacji (przynajmniej 3 metody)?

- porównanie tempa migracji z markerem masy w elektroforezie,

-pomiar długości konturowej w mikroskopie elektronowym

- sekwencjonowanie
15. Ze wzg na kopijność plazmidy dzielimy na niskokopijne,wielokopijne,jednokopijne
16. Do elektroforezy DNA w żelu PAA można zastosować następujące bufory TBE, bufor alkaliczny (EDTA, NaOH) (TAE jest używany tylko do agarozowych!!)
17. W żelach agarozowych można rozdzielić cz. DNA o wielkości 0,1 – 20 kpz
18. Stosując DEAE – celulozę do elucji DNA z żelu można oczyścić fragmenty DNA o wielkości od 500 pz do 5000 pz – inaczej 0,5-5kbp
19. Lizozym stosuje się do niszczenia ściany komórkowej bakterii w celu rozbicia komórki przed późniejszą ekstrakcją potrzebnych składników np. DNA, białka. Lizozym to inaczej enzym/białko trawiące wiązania w peptydoglikanie scian kom.
20. Składając próbkę do trawienia enzymami restry na 20μl dodasz 2ml buforu
21. jedna jednostka enzymu restrykcyjnego trawi w ciagu godziny 1 μg DNA
22. Wektory ekspresyjne charakteryzują się posiadaniem silnego promotora rozpoznawalnego przez polimerazę RNA gospodarza. Zawierają sekwencje regulujące transkrypcję i sekwencję do translacji obcego DNA
23. Wektory fagowe służą do klonowania większych fragmentów DNA
24. Kompetencja może być indukowana przez warunki wpływające hamująco na wzrost, warunki żywieniowe, gęstość populacji bakteryjnej
25. Najwyższą wydajność transformacji uzyskuje się gdy DNA ma konformację CCC
26. Bakterie elektropotentne przygotowuje się poprzez schłodzenie i przemycie wodą w celu zmniejszenia siły jonowej, a następnie zawiesza się w zimnym buforze zaw. 10% glicerol.
27. Wektory integracyjne różnią się od autonomicznych tym, że włączają się do komórki gospodarza, są stabilniejsze,ale występują w mniejszej liczbie kopii
28. Próbkę zawierającą 0,75 μg DNA należy trawić enzymami restry około …….. minut
29. Pseudopilusy są to…struktury (układy wydalnicze) u bakterii gram-ujemnych. Ich funkcją jest prawdopodobnie przenoszenie egzogennego DNA do ulokowanego w błonie cytoplazmatycznej systemu transportującego.
30. Wektory fagowe serii M13 znalazły zastosowanie do subklonowania odcinków DNA szczególnie w formie jednoniciowej

31. Stężenie DNA wynosi 300μg/ml. Złóż próbkę do trawienia analitycznego używając największej możliwej ilości DNA w tego typu trawieniu. Uwzględnij dokładne ilości wszystkich składników próbki (stężenie enzymu wynosi 5000U/ml) Końcowa objętość mieszaniny powinna wynosić 30μl.

32. Oceń stopień czystości preparatu DNA na podstawie odczytu spektrofotometrycznego A260 – 3,49, A280 – 2,18. Oblicz ilość DNA plazmidowego w 1ml wiedząc, że absorbancja próbki 100krotnie rozcieńczonej wynosiła 0,729.

33. Podczas sporządzania 2% żelu agarozowego na 50ml należy użyć ……. agarozy. Agarozę należy rozpuścić w…… Aby stężenie bromku etydyny w żelu wynosiło 0,5μg/ml należy dodać….. roztworu bromku etydyny o stężeniu 5mg/ml.

GRUBA B

1. Sekwencje palindromowe charakteryzują się posiadaniem 4,6,8 nukleotydów, osi symetrii, w wyniku cięcia postają dwa końce
2. Enzymy restry przecinając podwójną nić DNA pozostawiają na końcu 5’ grupę fosforanową A na końcu 3’ grupę OH
3. Forma OC migruje w żelu agarozowym wolniej niż forma CCC
4. Podczas rozdziału DNA w żelu agarozowym białka są widoczne w formie kompleksu DNA/białko zalegających w kieszonkach.
5. Wszystkie enzymy restry wymagają do swojego działania Mg2+
6. Podczas ekstrakcji fenolowej stosuje się mieszaniny mieszanina fenolu, chloroformu i alkocholu izoamylowego w proporcji 25:24:1

7. EDTA dodaje się do buforów służących do izolacji DNA w celu hamowania reakcji enzymatycznych i ochrony preparatu przed nukleazami
8. W izolacji DNA metodą lizy alkalicznej komórki barteryjne ulegają lizie pod wpływem EDTA i lizozymu
9. Plazmid krytyczny jest to plazmid zawierający minimalną ilość informacji genetycznej potrzebną do kodowania funkcji absolutnie niezbędnych do jego powielania nie pozostawiających praktycznie miejsca na kodowanie cech fenotypowych

10. Do trawienia na skalę analityczną używa się ilości DNA 0,05 ug – 1 ug
11. Składnikami buforów do obciążania próbek DNA rozdzielonych elektroforetycznie są gliceryna 30%, sacharoza 40%, ficol 15%
12. Stos absor A260/A280 mniejszy od 1,8 świadczy o obecności białka
13. Izoschizomery, to enzymy, które pochodzą z różnych szczepów i rozpoznają te same sekwencje DNA
14. Wymień formy w jakich mogą występować plazmidy koliste (ccc, oc), liniowe
15. Elektroforeza analityczna służy do charakterystyki badanego preparatu na danym etapie doświadczenia, do:

- ustalenie wielkości DNA,

- ilości preparatu,

- identyfikacji degradacji preparatu

- identyfikacji zanieczyszczeń w preparacie
16. Do elektroforezy DNA, w żelu agarozowym można zastosować następujące bufory TAE, TBE
17. W żelach PAA można rozdzielić cząsteczki DNA o wielkości 5 – 1000 pz
18. Elektroelucję w woreczkach dializacyjnych stosuje się do oczyszczania DNA o wielkości powyżej 5kb (duże wielkości)
19. Białka można oddzielić od DNA stosując nasycony bufor roztworu fenolu lub chloroform z alkocholem izoamylowym, albo mieszaninę fenolu z chloroformem i alkocholem izoamylowym 25;24;1

20. Składając próbkę do trawienia enzymami restry na 30μl dodasz 3μg buforu
21. Do głównych problemów podczas izolowania DNA z żeli należy rozpuszczalność białka, powstawanie ciał inkluzyjnych (?)
22. W organizmach prokariotycznych i ekuario mogą replikować się wektory wahadłowe
23. kosmidy zawierają sekwencję cos faga dzięki której pakują DNA do kapsydów fagocytowych.
24. Stan kompetencji bakterii charakteryzuje się ty, że bakteria ma zaburzony metabolizm.
25. Wyróżnia się następujące etapy transformacji : wiązanie DNA do powierzchni komórki, pobieranie DNA, faza eklipsy, integracja DNA do chromosomu
26. Elektroporacja polega na pobieraniu DNA po zadziałaniu na komórki krótkim impulsem elektrycznym. Jest szybką i wydajną metodą transformacji.
27. Wydajność transformacji zależy od następujących czynników(wymień 5) : użytego szczepu bakterii, związków chemicznych, fazy wzrostu komórek, ilości i wielkości DNA użytego, czasu inkubacji DNA z kom. kompetentnymi, czasu trwania szoku termicznego, czystości odczynników i szkła, jakości pożywki
28. Kosmidy zawierają następujące elementy : miejsce ori replikacji, gen markera selekcyjnego, miejsce do klonowania, sekwencję cos
29. System Tabora-Studiera został skonstruowany w celu wydajnej produkcji białek toksycznych dla komórek gospodarza E.Coli
30. Zjawisko „codon bias” polega na………

31. Stężenie DNA wynosi 400μg/ml. Złóż próbkę do trawienia analitycznego używając największej możliwej ilości DNA w tego typu trawieniu. Uwzględnij dokładne ilości wszystkich składników próbki (stężenie enzymu wynosi 2000U/ml) Końcowa objętość mieszaniny powinna wynosić 20μl.

32. Oceń stopień czystości preparatu DNA na podstawie odczytu spektrofotometrycznego A260 – 3,49, A280 – 2,18. Oblicz ilość DNA jednoniciowego w 1ml wiedząc, że absorbancja próbki 200krotnie rozcieńczonej wynosiła 0,900.

33. Podczas sporządzania 1,5% żelu agarozowego w 30ml należy użyć ……. agarozy. Agarozę należy rozpuścić w…… Aby stężenie bromku etydyny w żelu wynosiło 0,5μg/ml należy dodać….. roztworu bromku etydyny o stężeniu 5mg/ml.+

GR. B

Uzupełnij poniższe zdania:

1. Ciałka inkluzyjne są to agregaty, w których akumuluje się białko w formie nierozpuszczonej.

2. Aktywność „star” enzymów polega na obniżeniu lub na częściowym zaniku specyficzności enzymu co objawia się cięciem DNA w miejscach innych niż restrykcyjne.

3. Enzymy restrykcyjne przecinając podwójną nić DNA pozostawiają na końcu 5’grupę fosforanową a na końcu 3’grupę hydroksylową

4. Do trawienia DNA na skalę analityczną można użyć max….

5. W mieszaninie reakcyjnej do trawienia enzymami restrykcyjnymi bufor stanowi 1:10 końcowej objętości.

6. W wektorach z serii pet geny klonuje się pod kontrolą promotora faga T7 który ulega indukcji, gdy w środowisku pojawi się IPTG

7. Szybkość syntezy białka rekombinowanego można obniżyć przez (podaj 2 sposoby)

8. Złoże chromatografii metalopowinowactwa składa się z agarozy, kwas iminodioctowy (IDA), kwas nitrylotrioctowy (NTA), tris (TED)

9. Typowy rozdział chromatograficzny obejmuje następujące etapy:

1) zrównoważenie odpowiednim buforem

2) wprowadzenie do kolumny rozdzielanej mieszaniny związków

3) adsorpcja rozdzielanych cząsteczek białka z odpowiednim złożem

4) wymywanie niezwiązanych ze złożem składników

5)elucja z użyciem buforu

6) wymycie wszystkich substancji z kolumny, regeneracja złoża, powtórne równoważenie kolumny

1. W komórkach bakteryjnych podczas ukompentniania zachodzą następujące zmiany (4 wymienić)

-wytworzenie białek kompetencyjnych CF

-zahamowanie syntezy białek w komórkach bakteryjnych

-zahamowanie syntezy DNA

- indukcja profagów

-wzrost aktywności metylaz i enzymów zewnątrzkomórkowych

1. Białka rozdzielone w żelu poliakrylamidowym można wybarwić stosując (2 metody)

   1. Metody stosujące barwniki fluorescencyjne (fluochromy) np. SYPRO Orange

   2. Metoda barwienia srebrowego

   3. Metoda barwienie błękitem brylantowym Coomassiee R-250 (CBB R-250)

Odpowiedz na poniższe pytania:

1. W jaki sposób można określić wielkość plazmidu po izolacji( 3 metody i krótko opisać).

-porównanie tempa migracji z markerem masy w elektroforezie,

-pomiar długości konturowej w mikroskopie elektronowym

- sekwencjonowanie

1. Co to jest znacznik i w jakim celu przyłącza siędo białek rekombinowanych (podaj przykłady).

Jest to domena, krótki peptyd lub białko, w celu ułatwienia detekcji, oczyszczania lub zwiększenia rozpuszczalności białka

1. Wymień wady i zalety bakterii jako gospodarza do uzyskiwania białek rekombinowanych.

Zalety:

- zdolność do szybkiego wzrostu na tanich podłożach

- wysoki stopień scharakteryzowania genomu

- dostępność wielu wektorów i szczepów

-brak patogenności

Wady:

- brak mechanizmów modyfikacji potranslacyjnych

- brak mechanizmów sekrecji białek do podłoża

- nadprodukcja niektórych białek

- preparaty izolowane w celu terapeutycznym muszą być oczyszczone z lipolisacharydu

GR. A

Uzupełnij poniższe zdania:

1. Plazmid jest to autonomiczny, pozachromosomowy element genetyczny występujący u organizmów prokariotycznych i niektórych eukariontów.

2. Wyróżniamy następujące formy plazmidowego DNA:

Forma kolista CCC – superzwinięte, forma OC, forma liniowa – spinki do włosów

1. Elektroforeza analityczna służy do ….

2. W mieszaninie reakcyjnej do trawienia DNA enzymami restrykcyjnymi znajdują się następujące składniki: bufor, woda, enzym, DNA

3. Do trawienia DNA na skalę preparatywną można użyć maksymalnie 10ug (podaj ilość) DNA.

4. Jedna jednostka w ciągu godziny trawi 1ug (podaj ilość) DNA.

5. W systemie TABORA-STUDIERA gen kodujący białko rekombinowane klonuje się do wektora pod kontrolą promotora faga T7 dla enzymu polimerazy RNA

6. Ciałka inkluzyjne są to agregaty, powstałe w wyniku akumulacji formy nierozpuszczalnej białka.

7. Do białek rekombinowanych przyłącza się znaczniki w celu (3 cele).

- zwiększenie rozpuszczalności białka

- do oczyszczania białka na złożu

- do śledzenia losów białka

1. Chromatografia metalopowinowactwa pozwala na oczyszczanie białka rekombinowanego od pozostałych białek. Zasada tej techniki polega na zdolności odwracalnego wiązania jonów metali takich jak: ZN, Cu, Ni, czy Co przez reszty aminokwasowe występujące na powierzchni białek.

2. Elektroforeza białek według modyfikacji Laemmil’ego polega na tym, że w systemie nieciągłym, białko ulega koncentracji w żelu o bardzo rzadkim usieciowieniu ( dużych porach) nazywanym żelem zagęszczającym

Odpowiedz na poniższe pytania:

1. Jakie elementy musi posiadać plazmid, aby mógł być wektorem do klonowania (opisz jednym zdaniem każdy).

Ori – miejsce replikacji

Marker I – gen, który pozwala odróżnić bakterie posiadające plazmid, od tych, które go nie posiadają

Marker II – pozwala odróżnić bakterie, które pobrały plazmid bez wstawki, od takich, które go posiadają ( plazmid zrekombinowany)

Polilinker – niewielki, sztucznie utworzony odcinek DNA, zawierający sekwencje rozpoznawane przez wiele enzymów restrykcyjnych

1. Co to jest transformacja i jej etapy.

Proces pobierania przez komórki DNA z podłoża.

- wiązanie DNA do powierzchni komórki

- pobieranie DNA (jedna nić ulega odcięciu i strawieniu)

- faza eklipsy (DNA podczas wchodzenia do komórki zostaje otoczony białkami – tworzy się kompleks eklipsy chroniący DNA przed enzymami )

- integracja DNA do chromosomu

1. W jaki sposób określić czystość preparatu po izolacji(wymienić i scharakteryzować 2 metody)

Analiza spektrofotometryczna uzyskanego preparatu DNA (?)

GRUPA A

1. Sonifikacja jest metodą dezintegracji komórek opartą na działaniu wibracji tzw. fal kawitacji wywoływanych w roztworze przez ultradźwięki, które mechanicznie uszkadzają ścianę komórkową

2. Wysokowydajne systemy bakteryjne pozwalają uzyskać ekspresje rekombinowanego białka na poziomie nawet 50% wszystkich białek komórkowych

3. Szybkość syntezy białka w komórkach bakteryjnych można zmniejszyć przez obniżenie stężenia IPTG, obniżenie temperatury hodowli i/lub hodowli na podłożu minimalnym w przeciwieństwie do standardowo używanego podłoża pełnego.

4. Formowanie ciał inkluzyjnych zawierających białko rekombinowane może być korzystne ze względu na to, że ułatwia izolację, ponieważ zagregowane białko:

   • Występuje w wysokim stężeniu i łatwo można je oczyścić

   • Jest chronione przed ewentualna proteolizą

   • Występując w formie nieaktywnej, nawet jeśli jest potencjalnie toksyczne, nie hamuje wzrostu bakterii

5. Przed naniesieniem białek na żel poliakryloamidowy należy je denaturować używając czynnika redukującego – β-merkaptoetanolu lub DTT oraz 2% SDS i inkubując próbki w 100°C przez 3-5 minut

6. Po rozdziale białka uwięzione w żelu uwidacznia się przez tworzenie nie dość trwałego ciemnoniebieskiego kompleksu ze swobodnie penetrującym żel barwnikiem – błękitem brylantowym Coomassie R-550 (CBB R-250) a następnie odpłukanie z żelu nadmiaru (nie związanego z białkami) barwnika

7. Kwas octowy obecny w roztworach do trawienia białek ma za zadanie utrwalić położenie białka w żelu oraz zapewnić kwaśne środowisko potrzebne do wytworzenia kompleksów barwnika z białkiem

8. Najczulszą metodą barwienia żelu jest metoda barwienia srebrowego

9. Żeby zwiększyć rozpuszczalność rekombinowanych białek, na końcu N dołącza się białko maltoza

10. Największym problemem przy hodowlach E. coli na duża skalę w kulturach o dużej gęstości jest produkcja octanu, która pojawia się zwykle w warunkach ograniczonego natlenienia lub nadmiaru glukozy

11. Do indukcji promotora stosuje się IPTG

12. Do monitorowania ekspresji białka rekombinowanego w tkankach używa się białka GFP

13. Okres półtrwania mRNA w E. coli wynosi od kilku sekund do 20 minut

14. Na stabilność rekombinowanych białek znaczny wpływ ma reszta aminokwasowa występująca bezpośrednio po metioninie u E. coli, bo to od niej zależy wydajność usuwania formylometioniny

15. Powstawanie ciał inkluzyjnych można ograniczyć przez zmianę warunków hodowli, zastosowanie koekspresji izomeraz prolilowych a także wysoko lub niskocząsteczkowych białek opiekuńczych

16. Do oczyszczania białek z motywem His stosuje się najczęściej złoże chromatograficzne obniżając pH lub stosując imidazol

17. W celu uniknięcia izolacji białek, które mogą wiązać się z rekombinowanym białkiem z motywem His stosuje się dodatek β-merkaptoetanolu w buforach do lizy

18. Podczas oczyszczania białek rekombinowanych dodaje się detergentów, które zapobiegają oddziaływaniu oczyszczonego białka – His z innymi białkami i z kwasami nukleinowymi

19. Najważniejsze z punktu widzenia wydajności procesu izolacji białek jest etap dezintegracji komórek

20. Katalizatorem reakcji polimeryzacji monomerów akryloamidu i N,N – metylenobisakryloamidu jest TEMED (N,N,N,N – tetrametyloetylenodiamina), natomiast inicjatorer, tej reakcji jest nadsiarczan amonu – (NH₄)₂S₂O₈

21. Przed naniesieniem białek na żel przeprowadza się ich denaturacje stosując czynnika redukującego – β-merkaptoetanolu lub DTT oraz 2% SDS i inkubując próbki w 100°C przez 3-5 minut

22. Podstawowym substratem dla β-D-galaktozydazy jest laktoza

Grupa B

1. Homogenat to ekstrat komórkowy otrzymany po lizie komórek

2. Ciałka inkluzyjne to agregat , w których akumuluje się białko w formie nierozpuszczalnej

3. Zarówno poziom ekspresji jak i rozpuszczalność produkowanego białka można modyfikować zmieniając wektor, szczep bakteryjny i warunki hodowli

4. Do oczyszczania białka można wykorzystać dializę i chromatografię (jonowymienną, powinowactwa, HPLC)

5. Elektrofereza białek wg modyfikacji Laemmli’ego polega na tym, że, stosowany jest tzw. nieciągły system, polegający na użyciu buforów różniących się rodzajem jonów, siłą jonową i pH.

6. Przy prawidłowym wykonaniu procedury barwienia i odbarwiania barwnikiem CBB R-250 można wykryć już mniej niż 50 ng białka w postaci prążka.

7. Metanol stosowany w procedurze odbarwiania żeli ma za zadanie wytrącania białka i  rozpuszczenie barwnika.

8. Białka rozdzielone w żelach poliakrylamidowych można barwić używając następujących metod:

   • Metody stosujące barwniki fluorescencyjne (fluochromy) np. SYPRO Orange

   • Metoda barwienia srebrowego

   • Metoda barwienie błękitem brylantowym Coomassiee R-250 (CBB R-250)

9. Gen służący do nadprodukcji rekombinowanego białka najczęściej włącza się do plazmidu niskiej liczbie kopii, ponieważ replikacja nie może obciążać nadmiernie metabolizmu komórki

10. Promotor do produkcji heterologicznego białka powinien być łatwo indukowany i pozwalać na wydajną produkcje rekombinowanego białka

11. Do produkcji rekombinowanych białek wykorzystuje się najczęściej systemy pET

12. Aby ułatwić oczyszczanie białka metodą chromatograficzna dodaje się często heksapeptyd His₍₆₎

13. Pod względem budowy β-D-galaktozydaza jest enzymem katalizującym reakcję hydrolizy wiązań )-glikozydowych w β-D-galaktozydach

14. SDS nadaje białkom mocny ładunek ujemny

15. β-D-galaktozydaza wykorzystuje dwie aktywności hydrolityczną i transferazową

16. Reakcja polimeryzacji monomerów akryloamidu i N,N – metylenobisakryloamidu jest hamowana przez tlen z powietrza

17. Wektor może zwiększyć rozpuszczalność białka przez umożliwienie dołączenia polipeptydu, który jest sam łatwo rozpuszczalny lub sekwencji kierującej białko do przestrzeni peryplazmatycznej

18. Wiązanie białka z motywem His przeprowadza się zwykle w buforach zawierających niewielkie stężenie imidazolu, ponieważ zabezpiecza on przed niespecyficznym wiązaniem białek zawierających mniejszą ilość kolejno występujących reszt histydyny

19. Złoże używane do oczyszczania białek powinno być trwałe: odporne na modyfikacje chemiczne, proteolizę i powinno się nadawać do wielokrotnego wykorzystania — łatwe i skuteczne usuwanie pozostałości oraz regeneracja.

20. Do białek rekombinowanych dołącza się heksapeptyd w żelu poliakryloamidowym

21. Do oczyszczania białek z motywem His stosuje się złoże chromatograficzne