Izolacja DNA
Ściana komórkowa Staphylococcus aureus w 90% zbudowana jest z peptydoglikanu
Do reszt kwasu N-acetylo-D-muraminowego przyłączony jest peptyd pentaglicynowy, łączy się z kolejnym łańcuchem polisacharydowym tworząc silnie usieciowaną, trójwymiarową, sztywną strukturę
Lizostafina – enzym ze Staphylococcus simulans
Osad bakterii S. aureus z całonocnej hodowli w bulionie
+
Lizostafina w buforze Tris-HCl pH 7,4
Inkubacja w 37°C 30 min.
+
Chlorowodorek guanidyny 5 M
Inkubacja w temp. pokojowej 3 min.
szereg fenolowo – chloroformowy +
wytrącanie DNA etanolem absolutnym
Bakterie po lizie chlorowodorkiem guanidyny
Ekstrakcja DNA mieszaniną fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego
Wirowanie przy 12 000 * g przez 3 min.
Przeniesienie fazy wodnej zawierającej DNA do osobnej probówki
Faza wodna zawierająca DNA
Wytrącanie DNA etanolem
Temperatura pokojowa 3 min.
Wirowanie DNA przy 12 000 * g przez 3 min.
Zawieszenie DNA w wodzie
PCR
SEA - Staphylococcal Enterotoxin A
SEB
SEC
SED
Startery:
SEA sens + antysens
SEB sens + antysens
SEC sens + antysens
SED sens + antysens
Mieszanina fosforanów:
dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Bufor:
10mM Tris-HCl pH 8.8, 50mM KCl, 0.08% NP40, 1.5mM MgCl2
Polimeraza
DNA
30 CYKLI PCR:
94 °C - 15 s
50 °C - 15 s
72 °C - 30 s
Czas: ~ 1.1 h
Polimeraza Taq z Thermus aquaticus
Błędy 1 na 9,000 nukleotydów
Szybkość 2 000 pz / min.
Polimeraza Pfu z Pyrrococcus furiosus
Błędy 1 na 1.3 milionów nukleotydów
Szybkość 500 pz / min.
Polimerazy otrzymane na drodze inżynierii genetycznej:
Szybkość 6 000 pz / min.
Izolacja DNA
Ściana komórkowa Staphylococcus aureus w 90% zbudowana jest z peptydoglikanu
Do reszt kwasu N-acetylo-D-muraminowego przyłączony jest peptyd pentaglicynowy, łączy się z kolejnym łańcuchem polisacharydowym tworząc silnie usieciowaną, trójwymiarową, sztywną strukturę
Lizostafina – enzym ze Staphylococcus simulans
Osad bakterii S. aureus z całonocnej hodowli w bulionie
+
Lizostafina w buforze Tris-HCl pH 7,4
Inkubacja w 37°C 30 min.
+
Chlorowodorek guanidyny 5 M
Inkubacja w temp. pokojowej 3 min.
szereg fenolowo – chloroformowy +
wytrącanie DNA etanolem absolutnym
Bakterie po lizie chlorowodorkiem guanidyny
Ekstrakcja DNA mieszaniną fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego
Wirowanie przy 12 000 * g przez 3 min.
Przeniesienie fazy wodnej zawierającej DNA do osobnej probówki
Faza wodna zawierająca DNA
Wytrącanie DNA etanolem
Temperatura pokojowa 3 min.
Wirowanie DNA przy 12 000 * g przez 3 min.
Zawieszenie DNA w wodzie
PCR
SEA - Staphylococcal Enterotoxin A
SEB
SEC
SED
Startery:
SEA sens + antysens
SEB sens + antysens
SEC sens + antysens
SED sens + antysens
Mieszanina fosforanów:
dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Bufor:
10mM Tris-HCl pH 8.8, 50mM KCl, 0.08% NP40, 1.5mM MgCl2
Polimeraza
DNA
30 CYKLI PCR:
94 °C - 15 s
50 °C - 15 s
72 °C - 30 s
Czas: ~ 1.1 h
Polimeraza Taq z Thermus aquaticus
Błędy 1 na 9,000 nukleotydów
Szybkość 2 000 pz / min.
Polimeraza Pfu z Pyrrococcus furiosus
Błędy 1 na 1.3 milionów nukleotydów
Szybkość 500 pz / min.
Polimerazy otrzymane na drodze inżynierii genetycznej:
Szybkość 6 000 pz / min.
Metoda pozwalająca na ocenę wielkości fragmentów DNA w mieszaninie.
Ujemnie naładowane cząsteczki DNA w polu elektrycznym wędrują do elektrody dodatniej (anody).
Usieciowanie żeli wywołuje różnice w prędkościach wędrówki cząsteczek, tak że najszybciej wędrują cząsteczki najmniejsze
Żele poliakrylamidowe stosuje się do rozdzielania fragmentów DNA do 500 bp. Żele agarozowe do fragmentów większych
Wraz z fragmentami DNA o nieznanych masach w żelach rozdziela się jednocześnie standardy masy – mieszaninę fragmentów DNA o znanych, ściśle określonych masach cząsteczkowych
Wizualizacja rozdzielonych fragmentów DNA
bromkiem etydyny w przypadku elektroforezy w agarozie, srebrem w przypadku elektroforezy w poliakrylamidzie
Toksyny, które podane doustnie małpom są zdolne do wywoływania u nich wymiotów
enterotoksyny właściwe
SE - staphylococal enterotoxin
Enterotoksyny gronkowcowe w zatruciach pokarmowych
Za ponad 90-95% zatruć gronkowcowych
odpowiadają
enterotoksyny SEA-SED