1. Barwniki hemowe:

Budowa: hemoglobina i mioglobina są chromoproteinami występującymi w produktach pochodzenia zwierzęcego. U żywych zwierząt ok. 90% żelaza występuje w hemoglobinie w czerwonych ciałkach krwi a tylko 10% w mioglobinie (czerwonym barwniku mięsa). Po wykrwawieniu zwierząt w czasie uboju, głównym barwnikiem mięsa jest mioglobina a jej zawartość oraz przemiany decydują o zabarwieniu mięsa i jego przetworów.

Hemoglobina i mioglobina zawierają w swojej cząsteczce płaski pierścień porfirynowy hemu z dwuwartościowym atomem żelaza wbudowanym w centrum pierścienia. Hem jest cyklicznym tetrapirolem. Składa się z 4 pierścieni pirolowych połączonych mostkami a -metinowymi, a w pozycji b znajdują się grupy metylowe, winylowe i propanionowe. W centrum tego układu znajduje się atom żelaza, jest on powiązany z czterema atomami azotu. Pirolowe atomy azotu wiażą jon żelaza w pozycji ekwatorialnej, udostępniając dwie pozycje aksjalne dla innych ligandów. Atom żelaza może tworzyć dodatkowe dwa wiązania- każde po jednej płaszczyźnie hemu. Miejsca te określa się jako piąta i szóstą pozycję koordynacyjną.

W mioglobinie cząsteczka hemu połączona jest z jedną cząsteczką globiny. Istotnym elementem budowy mioglobiny jest czwartorzędowa struktura globiny. Łańcuch peptydowy tego białka jest tak pofałdowany, że tworzy hydrofobową niszę, w którą wbudowany jest płaski pierścień hemu, połączony z globiną piątym wiązaniem koordynacyjnym między żelazem a azotem grupy histydynowej białka. Masa cząsteczkowa białka występującego w mioglobinie wynosi 17 kDa.

Cząsteczka hemoglobiny zbudowana jest podobnie ale z czterech łańcuchów peptydowych i każdy z nich jest powiązany z jedną cząsteczką hemu.

Stopnie utlenienia żelaza oraz barwa poszczególnych form: obydwa barwniki hemowe mają zdolność odwracalnego wiązania tlenu cząsteczkowego. Cząsteczka tlenu jest wiązana z atomem żelaza, wbudowanym w pierścień porfirynowy, przez szóste, wolne wiązanie koordynacyjne.

Reakcje mioglobiny z tlenem mają istotny wpływ na barwę mięsa. W obecności powietrza ciemnoczerwona mioglobina MbFe(II) przyłącza cząsteczkę tlenu i powstaje jasnoczerwona, utlenowana, magazynująca tlen oksymioglobina MbFe(II)O₂. Jest to reakcja odwracalna. Ogrzewanie mięsa powoduje denaturację białka związanego z hemem i odsłonięcie Fe(II), które ulega utlenieniu do Fe(III) i z oksymioglobiny powstaje szarobrunatny metmiochromogen [Fe(III)]. Jest to rekacja nieodwracalna. Szarobrunatna metmioglobina MbFe(III) powstaje z mioglobiny w wyniku reakcji utleniania atomu żelaza. Jest to reakcja odwracalna (redukcja metmioglobinymioglobina). Posiada ona niezdenaturowane białko hemu, jednak pod wpływem ogrzewania mięsa następuje denaturacja globiny i powstaje szarobrunatny metmiochromogen. W następstwie denaturacji składnika białkowego, bezpośrednio z mioglobiny powstaje miochromogen [czerwony, Fe(II)]. Karboksymioglobina powstaje w wyniku łączenia się mioglobiny z tlenkiem węgla(II). W warunkach fizjologicznych stanowi ok. 1% mioglobiny a wędzonemu mięsu nadaje charakterystyczny czerwony kolor. W wyniku ogrzewania mięsa następuje denaturacja białka związanego z hemem i z karboksymioglobiny powstaje karboksymiochromogen (czerwony). W wyniku utleniania z karboksymiochromogenu powstaje metmiochromogen szarobrunatny [z Fe(II) Fe(III)].

Zdenaturowane białko odbija więcej światła – dlatego nastąpiło pojaśnienie barwy.

Pochodne hemo- i mioglobiny:

• Methemoglobina - utleniona hemoglobina powstała w wyniku reakcji przyłączania tlenu, co związane jest ze zmianą stopnia utlenienia żelaza wchodzącego w skład hemoglobiny z II na III. Cyjanek potasu (lub cyjanowodór) łatwo wiążą się z methemoglobiną tworząc cyjanomethemoglobinę.

• Hemichromogen – chloroform powoduje denaturację białek i to pod jego wpływem z methemoglobiny powstaje hemichromogen [Fe(III)]

• Hemochromogen – pod wpływem denaturacji globiny, z hemoglobiny powstaje hemochromogen, w którym żelazo występuje na II st. utlenienia. Hemochromogen może przejść w hemichromogen pod wpływem utleniania [Fe(II) Fe(III)].

• Karboksyhemoglobina – powstaje w wyniku łączenia się hemoglobiny z tlenkiem węgla(II).

Karboksyhemoglobina może przejść w methemoglobinę (reakcja utleniania a jednocześnie odłączenie CO).

• Oksyhemoglobina – jest to nietrwałe połączenie hemoglobiny z tlenem. Powstaje w płucach, jest transportowana do tkanek przez krew, gdzie oddaje tlen mioglobinie i zamienia się w hemoglobinę.

Hemoglobinę można otrzymać poprzez działanie hydrosulfitem (Na₂S₂O₄, ditionin sodu) na oksyhemoglobinę.

Oksyhemoglobina może przejść w:

• karboksyhemoglobinę (łączenie się z CO); tlenek węgla (II) ma ponad 200 razy większe powinowactwo do Hb i wypiera tlen z oksyhemoglobiny.

• methemoglobinę (hemiglobinę) – przejście żelaza na III st. utlenienia, oddanie cząsteczki tlenu

• hemochromogen – pod wpływem zasady i Na₂S₂O₄ globina zostaje zdenaturowana.

• heminę – pochodna hemu posiadajaca trójwartościowy atom żelaza, ekstrahowana z oksyhemoglobiny pod wpływem NaCl + CH₃COOH lodowaty. W wyniku reakcji redukcji i w obecności NaOH z heminy powstaje hem (z dwuwartościowym atomem żelaza) a po połączeniu się hemu z cząsteczkami globiny – hemoglobina. W odwracalnej reakcji z heminy powstaje hematyna (pod wpływem NaOH lub HCl, w zależności od kierunku reakcji) a po połączeniu się hematyny (zawierającej trójwartościowe żelazo) z globiną powstaje methemoglobina. Również przejście hematyny w hem jest odwracalne; z hemu tworzy się hematyna pod wpływem utleniania a z hematyny hem – pod wpływem redukcji. Uwaga! Wyjaśniam różnicę między heminą a hematyną: „Wiadomo, że hemoglobina przy działaniu kwasów lub alkalijów rozkłada się na ciało białkowate, globinę i substancję barwnikową hematynę, albo- przy użyciu kwasu solnego- heminę, zawierającą chlor i tworzącą połączenie z alkoholem amylowym, z którego ją przekrystalizowano. Hematyna powstaje wprost z hemoglobiny przy rozkładzie jej ługiem (wodny roztwór NaOH), lub też za pomocą tegoż odczynnika można ją otrzymać z heminy; przy czym, jak to widać przy porównaniu dwu wzorów, następuje odczepienie cząsteczki kwasu solnego i przyłączanie natomiast cząsteczki wody, czyli zamiana jednego ciała na drugie polega na zastąpieniu chloru przez grupę wodorotlenową.” z czasopisma Wszechświat, rok 1888

Sposób oznaczania ogólnego poziomu barwników hemowych (środowisko oznaczenia, w jakiej formie oznaczane są barwniki):

Poziom barwników hemowych w mięśniach określany jest na podstawie zawartości hematyny według metody Hornsey’a. Hematyna, czyli utleniony hem ekstrahowana jest w środowisku kwasowym za pomocą zakwaszonego acetonu (mieszanina acetonu, stężonego kwasu solnego i wody w stosunku – 40:1:2). Rozkład hemoglobiny na globinę i substancję barwnikową zachodzi pod wpływem tlenu, wtedy to w wyniku reakcji utleniania z hemu powstaje hematyna, natomiast aceton służy denaturacji związanego z hemem białka.

Wg Hornsey’a ekstrakcja barwników hemowych jest kompletna, jeżeli stosunek A₅₁₂/A₆₄₀ nie przekracza 2.0.

Zawartość barwników w mg hematyny/100g mięsa obliczyć ze wzoru:

Zs = A₆₄₀ ∙ 680

gdzie:

Zs – suma barwników hemowych wyrażona w mg hematyny/100 g mięsa

A₆₄₀ – absorbancja przy długości fali 640 nm.

Barwniki roślinne: budowa i przemiany chlorofili w środowisku zasadowym i kwaśnym:

Chlorofil jest zaliczany do barwników porfirynowych, czyli do związków w których podstawowy szkielet cząsteczki stanowi układ czterech pierścieni pirolowych połączonych przez grupy metinowe. W centrum cząsteczki występuje atom magnezu, połączony wiązaniami kowalencyjnymi i koordynacyjnymi z czterema atomami azotu pierścieni pirolowych. Dla chlorofilu charakterystyczne jest występowania dwóch grup karboksylowych z których jedna, przy C-7, jest zestryfikowana 20-węglowym alkoholem terpenowym – fitolem, a druga przy C-10 – metanolem.

U roślin wyższych występują: chlorofil a – niebieskozielony, w którym przy C-3 występuje grupa metylowa; chlorofil b – żółtozielona, z grupą formylową przy C-3.

Chlorofile uważane są za najmniej trwałe barwniki roślinne. W chloroplatach są powiązane ze specyficznym białkiem chloroplastyną oraz fosfolipidami i w tej formie są stabilne. Zniszczenie struktury tkankowej przez ogrzewania lub działanie rozpuszczalnikami, powoduje denaturacjię białka i przyspiesza przemiany, a więc i zmiany barwy chlorofilu. Kierunek i zakres przemian zależy od pH środowiska. Barwniki chlorofilowe ulegają nieodrwacalnym przemianom zarówno pod wpływem kwasów jak i zasad:

• pod wpływem rozcieńczonych kwasów zachodzi wymiana magnezu na dwa wodory i powstaje rozpuszczalna w tłuszczach, oliwkowozielona feofityna.

• w silnie kwaśnym środowisku, nie tylko zostaje usunięty magnez, ale również zachodzi hydroliza wiązań estrowych, a więc oderwanie fitolu, zwiększającego hydrofobowość cząsteczki chlorofilu i w rezultacie powstaje rozpuszczalny w wodzie, brunatny feoforbid.

• w środowisku zasadowym zachodzi hydroliza wiązań estrowych bez usunięcia magnezu. Powstające w tych warunkach chlorofiliny zachowują zieloną, naturalną barwę, a ich sole sodu i potasu są dobrze rozpuszczalne w wodzie.

• W wyniku działania chlorofilazy lub słabych zasad, zachodzi selektywna hydroliza wiązania estrowego, łączącego fitol z resztą kwasu propionowego i powstają rozpuszczalne w wodzie, zielone chlorofilidy.

Jak z tego wynika czynnikami przyspieszającymi zmiany barwy zielonych warzyw, np.: groszku, fasolki szparagowej, szpinaku czy ogórków są nawet niewielkie ilości kwasów, uwalniane lub dodawane w czasie produkcji przetworów warzywnych oraz niektóre enzymy, głównie chlorofilaza. Aby zapobiec tym niekorzystnym przemianom, można stosować blanszowanie w wodzie z dodatkiem wodorotlenku wapnia lub magnezu w celu podwyższenia pH od 7,5-8,0.

Pod wpływem wysokiej temperatury, np. w czasie sterylizacji fasolki szparagowej, obok feofityna tworzy się pirofeofityna, która powstaje w wyniku oderwania od feofityna grupy – COOCH₃. Proces zachodzi zgodnie z reakcją I rzędu, przy czym chlorofil a ulega degradacji szybciej niż chlorofil b.