Immunologia – wejściówka 26.10.2012

Podstawowe zasady BHP

Typy zagrożeń bezpieczeństwa:

• Zagrożenia biologiczne

  • Prawidłowe mycie rąk

  • Środki ochrony indywidualnej

  • Właściwe składowanie odpadów

• Zagrożenia chemiczne

• Szeregi rozcieńczeń

Zagrożenia biologiczne – czynniki zakaźne np. infekcje bakteryjne, pasożyty.

Ostre narzędzia np. tłuczone szkło

W laboratorium immunologicznym zagrożeniem dla pracownika jest kontakt z materiałem biologicznym.

Trzy elementy niezbędne do wystąpienia zagrożenia biologicznego:

• Źródło

• Droga transmisji

• Gospodarz

Technika mycia rąk

• Ręce płukać pod bieżącą wodą

• Z dozownika pobrać mydło w płynie i zgodnie z podaną techniką myć ręce przez około 30s

• Wypłukać ręce pod bieżącą wodą

• Ręce dokładnie osuszyć papierowym ręcznikiem, którym następnie należy zakręcić kran

• Zużyty ręcznik wyrzucić do pojemnika na odpady

Ręce myjemy zawsze przed kontaktem z pacjentem, po zdjęciu rękawiczek, gdy opuszczamy salę ćwiczeń, w chwili gdy możemy ulec skażeniu, przed i po skorzystaniu z urządzeń sanitarnych.

Środki ochrony indywidualnej

• Rękawiczki

• Fartuchy

• Maski

• Okulary

• Czepki

Typy rękawiczek ochronnych
Do pracy z materiałem zakaźnym: lateksowe, winylowe, PCV, polipropylenowe. Należy wybrać odpowiedni typ rękawiczek w zależności od spełnianych funkcji. Zawsze po zdjęciu należy myć ręce. Fartuch musi być zapięty na ostatni guzik! Zawsze należy zawiązywać włosy!. Odzież ochronna musi być wykonana z materiałów niepalnych. Nigdy nie jemy, nie pijemy w pracowni. Miejsce pracy powinno być posprzątane.

Odpady medyczne

• Suche, stałe

• Pojemniki, probówki, pipety, końcówki do pipet

• Płyny ustrojowe, krew

Urządzenia potrzebne do wykonywania ćwiczeń

• Służą do przenoszenia i odmierzania cieczy

• Występują trzy rodzaje pipet laboratoryjnych

  • Pipeta Pasteura – najprostszy rodzaj pipety, rurka szklana lub plastykowa. Pobierają bardzo małe objętości

  • Pipety miarowe

  • Pipety automatyczne – to specjalne pipety miarowe. Jej mechanizm składa się z:

    • Precyzyjnego tłoczka ze sprężynką

    • Rączki

    • Regulatora wymiennej końcówki

Odmierzana ciecz jest odmierzana tylko do końcówki.

Rozcieńczanie roztworów.

Wyrażane w postaci ułamka. Stosunek rozcieńczenia – objętość próbki całkowitej objętości roztworu przy czym objętość końcowa jest równa objętości próby i objętości rozpuszczalnika

Rozcieńczenie 1/10 = objętość probówki/objętość rozpuszczalnika = 1ml/1+9ml

Temat: Metody barwienia różnicowego komórek. Wykonanie preparatów, barwienie i różnicowanie komórek

Metody barwienia i różnicowania komórek:

• Barwienia preparatów mikroskopowych

  • Barwienie preparatów hematologicznych

  • Barwienie preparatów mikrobiologicznych

• Immunohistochemia

Barwienie komórek – organelle znajdujące się w komórkach identyfikowane są używając różnorodnych pigmentów i barwników. Za pomocą technik barwienia można zaobserwować duże organelle komórkowe.

Standardowa technika barwienia – eozyna-hematoksylina.

Eozyna jest kwaśnym barwnikiem, który wykazuje powinowactwo chemiczne z białkami cytoplazmy. Zabarwia głownie cytoplazmę. Zabarwione w ten sposób struktury nazywane są eozynofilnymi. Hematoksylina to podstawowy barwnik, który wykazuje powinowactwo z rybonukleoproteinami jądra. Barwi głównie jądro, a zabarwione struktury są bazofilnymi.

Istnieje również wiele sposobów barwienia, które używane są do wizualizacji poszczególnych tkanek. Krew obwodowa i szpik kostny są barwione techniką May-Grunwalda Giemzy. Wykonuje się w celu oceny leukocytów, erytrocytów i płytek krwi.

• Rozmaz wykonuje się na szkiełku podstawowym z krwi wersanianowej żylnej lub włośniczkowej (jednak nie później niż 2h od pobrania). Krew wersenianową dokładnie, ale delikatnie wymieszać.

• Nanieść niewielką kroplę krwi na szkiełko podstawowe ok. 1 cm od brzegu.

• Powyżej kropli opieramy rozmazówkę do kropli krwi tak aby cała krew równomiernie rozmieściła się między szkiełkami.

• Jednym zdecydowanym ruchem bez dociskania rozprowadzić krew utrzymując kąt między szkiełkami około 45⁰.

• Natychmiast suszyć rozmaz poprzez wykonanie kilku szybkich ruchów rozmazem w powietrzu – faza szybkiego suszenia.

• Podpisać rozmaz zwykłym ołówkiem w jego najgrubszej części.

• Imię i nazwisko pacjenta, ewentualnie data i numer badania.

• Postawić rozmaz na powietrzu w temp. Pokojowej na ok. 1 h – faza wolnego suszenia.

W ten sam sposób wykonywać drugi preparat dla tego samego pacjenta – preparat rezerwowy w razie wątpliwości i wiarygodności pierwszego pomiaru.

Prawidłowo wykonany rozmaz:

• Ma barwę żółtoróżową

• Jest coraz cieńszy ku końcowi

• Ma jednolitą powierzchnię bez smug, „schodków” , dziur

• Ma odpowiednią grubość, nie jest zbyt cienki ani zbyt gruby. W zbyt grubym rozmazie trudno różnicować komórki (szczególnie blastyczne)

• Ma długość 3-4 cm i sięga do 2/3 szkiełka

• Brzegi rozmazu nie dochodzą do brzegów szkiełka podstawowego

• Zakończony jest brodą

Najczęściej stosowaną metodą z użyciem dwóch barwników: May-Grunwalda i Giemzy

W skład barwników wchodzą:

• May-Grunwalda: błękit metylenowy, eozyna, metanol

• Giemzy: błękit metylenowy, eozyna i ażur

Do barwienia stosuje się rozcieńczony barwnik May-Grunwalda dzięki czemu preparat nie musi być utrwalany (gdyż w skład barwnika wchodzi alkohol metylenowy). Eozyna jest barwnikiem kwaśnym, który barwi zasadowe struktury komórkowe (hemoglobina).

Ogólny schemat

Wysuszony preparat barwimy zgodnie z instrukcją podaną przez producenta barwników

1. Zalać preparat May-Grunwalda na 3-5 minut

2. Spłukać wodą destylowaną lub wodociągową

3. Zalać preparat rozcieńczonym barwnikiem Giemzy 13-15 min

4. Spłukać wodą destylowaną lub wodociągową

5. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej

Wyniki barwienia:

• Cytoplazma

  • Zasadochłonna – niebieska (limfocyty, monocyty, plazmocyty)

  • Kwasochłonna – w różnych odcieniach różu i czerwieni (erytrocyty, granulocyty)

  • Amfoteryczna – w różnych odcieniach fioletu

• Jądro komórkowe – odcienie fioletu – młodsze postacie jaśniejsze, starsze ciemniejsze

• Ziarnistości

  • Azurochłonne – w odcieniach fioletowe od granatu do czerwieni (w granulocytach obojętnochłonnych, monocyty, limfocyty)

  • Kwasochłonne – żółtobrunatne (w eozynofilach)

  • Zasadochłonne – ciemnofioletowe z czerwoną poświatą (w bazofilach)

Wybarwiony i wysuszony preparat oglądamy w powiększeniu 1000-krotnym (10 okular x 100 obiektyw) z użyciem olejku immersyjnego. Oceniamy wszystkie komórki obecne w rozmazie:

• Leukocyty – oceniamy morfologię i różnicujemy na poszczególne klasy

• Erytrocyty – oceniamy morfologię (wielkość, kształt, wybarwienie, występowanie wtrętów, rulonizację, aglutynację)

• Płytki krwi – oceniamy morfologię i występowanie agregatów

Decydujący wpływ na wynik badania na wybór odpowiedniego miejsca do oceny morfologii komórek. Preparaty oceniamy najczęściej w 2/3 długości rozmazu gdzie:

• Erytrocyty są ułożone równomiernie nie nakładają się na siebie, ale nie ma też między nimi wolnych przestrzeni

• W erytrocytach dobrze widoczna jest della, czyli przejaśnienie .

Po rozmazie poruszamy się linią meandrową, inaczej ruchem konika szachowego, ponieważ większe komórki np. monocyty itp. Ponieważ komórki te występują raczej w bocznej i dolnej części preparatu.

Wartości prawidłowego leukogramu

• Granulocyty

  • Obojętnochłonny

    • O jądrze pałeczkowatym 3-6%

    • O jądrze podzielonym 58-66%

  • Kwasochłonne 2-4%

  • Zasadochłonne 0-0,5%

• Limfocyty 20-45%

• Monocyty 4-5%

Granulocyt obojętnochłonny o jądrze pałeczkowatym

• Kształt okrągły lub owalny

• Cytoplazma – różowa, ziarnistości nieliczne, azurochłonna i obojętnochłonna

• Jądro: nie jest podzielone, płaty, pałeczkowate

Granulocyt obojętnochłonny o jądrze podzielonym:

• Kształt okrągły lub owalny

• Jądro komórkowe z ok 5 płatów

• Cytoplazma – różowa, ziarnistości nieliczne azurochłonna i obojętnochłonna

Granulocyt kwasochłonny

• Okrągły lub owalny kształt

• Cytoplazma – różowa zwykle zakryta ziarnistościami

• Ziarnistości – bardzo liczne, barwy od złocistej do brunatnej, kwasochłonne

• Jądro – dwupłatowe

Granulocyt zasadochłonny

• Owalny lub okrągły kształt

• Cytoplazma – różowa (blada) zwykle zakryta

• Ziarnistości – różne wielkości metachromatyczne, koloru atramentowego

• Jądro – płatowe

Limfocyty

• Średnica limfocytów jest różna około 9-12 μm

• Jądro – owalne, okrągłe

• Jąderko - w barwieniu MGG są niewidoczne

• Cytoplazma – niebieska w różnych odcieniach

• W cytoplazmie niektórych komórek mogą występować ziarnistości azurochłonne (czerwono-fioletowe błyszczące, dość grube o ostrych nieregularnych kształtach)

• Limfocyty to komórki układu odpornościowego należące do agranulocytów. Uczestniczą i są podstawą do odpowiedzi odpornościowej swoistej. Stężenie limfocytów we krwi obwodowej człowieka wynosi 1,1 – 3,5 x 10⁹/l. Co stanowi 25 – 35% populacji leukocytów

Wszystkie limfocyty oraz komórki NK rozwijają się ze wspólnej progenitorowej komórki limfopoezy pochodzącej z komórki macierzystej hemopoezy. Większość limfocytów dojrzewa w grasicy, natomiast limfocyty B powstają w czerwonym szpiku kostnym i nigdy nie przechodzą przez grasicę.

Limfocyty B – są odpowiedzialne za rozpoznawanie antygenu i wytwarzanie przeciwciał.

• Limfocyty B1 – 20% limfocytów B we krwi obwodowej dominują w okresie płodowym, wytwarzają autoprzeciwciała oraz mają czynny udział w usuwaniu pozostałości po aptozie

• Limfocyty B2 – zasadnicza, dominująca subpopulacja

Limfocyty T – są odpowiedzialne za odpowiedź komórkową

• Limfocyty Tc – są odpowiedzialne za zabijanie komórek docelowych

• Limfocyty Th – wspomagają odpowiedź immunologiczną, wydzielanie cytokiny

• Limfocyty Treg – hamują odpowiedź immunologiczną, wydzielają cytokiny

• Limfocyty Tγδ – uczestniczą w odpowiedzi przeciwzapalnej i przeciwnowotworowej

Komórki NK – cechy zarówno limfocytów T jak i komórek NK

Monocyty

• Największe komórki widoczne w prawidłowym rozmazie krwi obwodowej średnica 16-20 μm. Nieregularny kształt: okrągły lub owalny

• Jądro – nieregularne. Przypomina litery J, E, L, U

• Cytoplazma niebieskosina

• Ziarnistości – nieobecne lub azurochłonne ziarnistości ułożone o jednym lub kilku skupisach

• W cytoplazmie obecne są wodniczki