Patomorfologia, ćw. 1 – Wiadomości wstępne o technice histopatologicznej

Metody pobierania materiału do oceny histopatologicznej:

- biopsja – przyżyciowe pobieranie materiału do badań histopatologicznych,

- nekropsja – pośmiertne pobranie tkanek podczas przeprowadzanej sekcji (autopsji) padłych zwierząt.

Metody biopsyjne

różnią się między sobą zarówno techniką wykonywania jak i rodzajem informacji, jakie można przy ich zastosowaniu uzyskać, jak również charakterem objawów ubocznych będących efektem traumatyzacji tkanek.

Wybierając metodę biopsyjną należy wziąć pod uwagę:

- stan kliniczny pacjenta,

- rodzaj informacji jaką chcemy uzyskać,

- lokalizację anatomiczną zmiany oraz narząd lub tkankę w jakiej się ona znajduje.

Metody biopsyjne najczęściej stosowane w diagnostyce wet.:

- cytodiagnostyka,

- biopsja z zastosowaniem igieł lub kleszczyków biopsyjnych,

- biopsja chirurgiczna.

Po pobraniu próbek poddaje się je badaniom cytologicznym , … bad. histopatologicznym

Cytodiagnostyka – to metoda rozpoznawania zmian, gł. Nowotworowych, oparta o analizę mikroskopową zmian morfologicznych izolowanych komórek, które oceniane są w rozmazach cytologicznych.

W zależności o metody pobierania materiału do badań wyróżniamy cytodiagnostykę:

1.Złuszczeniową – opartą na ocenie komórek pobranych z powierzchni zmienionych tkanek za pomocą wymazu, zeskrobania lub komórek złuszczonych samoczynnie. Metodę tę stosuje się w przypadku zmian znajdujących się w skórze, błonach śluzowych, błonach surowiczych. W przypadku zmian o łatwym dostępie materiał pobieramy przy pomocy szczoteczki cytologicznej, wymazu lub delikatnie zeskrobujemy z powierzchni przy pomocy skalpela lub krawędzią szkiełka podstawowego. Następnie wykonujemy rozmaz materiału na czystym, odtłuszczonym szkiełku podstawowym. W przypadku zmian zlokalizowanych w niedostępnych do badania bł.śluz. dróg oddechowych lub przewodu pokarmowego materiał można pobrać endoskopem wyposażonym w odpowiednią końcówkę.

Odmianą tej metody jest pobranie materiału przez irygację (wypłukanie) samoczynnie złuszczających się komórek z guzów znajdujących się w zamkniętych przestrzeniach, a następnie badanie cytologiczne osadów. Metodę tę stosujemy przy podejrzeniu:

-nowotworu płuc (popłuczyny oskrzelowo-pęcherzykowe),

-raka żołądka (popłuczyny żołądkowe),

-nowotworów pęcherza moczowego i gruczołu krokowego.

-materiał taki można otrzymać także przez punkcję jamy brzusznej lub klatki piersiowej.

Płynny lub półpłynny materiał należy odwirować przez 5-10 min przy …….obr/min. Następnie usunąć płynną frakcję, a z osadu wykonać bad. cytologiczne.

2. Cytodiagnostykę odbitkową- rozpoznanie morfologiczne ustala się na podstawie wyglądu morfologicznego komórek uzyskanych z powierzchni przekroju świeżo usuniętego guza lub z powierzchni wrzodziejących zmian skórnych. Zmianę po chirurgicznym usunięciu przecina się, osusza delikatnie powierzchnię przekroju za pomocą bibuły, a następnie przykłada się ją do powierzchni szkiełka podstawowego celem odbicia znajdujących się tam komórek.

3. Cytodiagnostykę aspiracyjną – materiał do oceny mikroskopowej stanowią komórki zaaspirowane z głębi zmiany za pomocą cienkiej igły (średnica poniżej 1 mm). Dlatego metodą określa się mianem biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej (BAC). Ze względu na łatwość wykonania oraz niewielkie ryzyko dla pacjenta jest ona najczęściej stosowana przez klinicystów. W przypadku guzów trudniej osiągalnych lub zmian zlokalizowanych w narządach wew., nakłucie można wykonać pod kontrolą USG, endoskopu, laparoskopu. Zwiększa to bezpieczeństwo oraz umożliwia precyzyjne pobranie materiału.

Wyposażenie do przeprowadzenia BAC:

- igła o średnicy 0,6-0,9 mm,

- strzykawka o poj. 5-20 ml (może być osadzona w specjalnym uchwycie),

- odtłuszczone szkiełka podstawowe,

- utrwalacz (96% alkohol, mieszanina 96% alkoholu i eteru w stosunku 1:1, utrwalacz w aerozolu, np. merkofix).

Kolejność czynności przy BAC:

1. Przygotowanie i odkażenie okolicy nakłucia.

2. Ustalenie i unieruchomienie nakłuwanego guza palcami jednej ręki.

3. Nakłucie igły z podłączoną strzykawką w miąższ zmiany.

4. Wytworzenie podciśnienia w strzykawce przez odciągnięcie tłoka do tyłu (nie jest wymagane w przypadku guzów o miękkiej konsystencji).

5. Zwolnienie tłoka w celu wyrównania ciśnienia (nie wykłuwając igły ze zmiany, skierować ją w inny obszar guza i ponownie odciągnąć, następnie zwolnić tłok strzykawki).

6. Wykłucie igłę z miąższu guza.

7. Odłączenie igły od strzykawki i zaaspirowanie do strzykawki powietrza.

8. Ponowne połączenie igły ze strzykawką i energiczne wypchnięcie zawartości na szkiełko podstawowe oraz wykonanie rozmazu.

Sposoby utrwalania materiałów cytologicznych:

- „na sucho”, pozostawiając materiały do całkowitego wyschnięcia (nie używając gorącego nadmuchu),

- „ na mokro”, przez zanurzenie szkiełek z rozmazami w płynie utrwalającym na 5-10 minut, suszenie.

Następnie należy przesłać odpowiednio zabezpieczone preparaty, zaopatrzone w pisma przewodnie do laboratorium. W każdym przypadku pismo przewodnie powinno zawierać:

- dane zwierzęcia,

- dane właściciela,

- dane jednostki przesyłającej,

- opis zmiany, z której pobrano materiał – lokalizacja, wygląd makroskopowy, rodzaj wzrostu, czas trwania, inne uwagi.

Zalety metody cytologicznej:

• Łatwość pobrania materiału.

• Możliwość przeprowadzania zabiegu bez znieczulenia.

• Niewielka traumatyzacja tkanek.

• Możliwość pobrania materiału z kilku miejsc guza.

• Możliwość otrzymania wyniku w krótkim czasie.

Wady metody cytologicznej:

• Nie może być traktowania jako badanie ostateczne.

• Konieczność weryfikacji badaniem histopatologicznym po chirurgicznym usunięciu zmiany.

• Rozpoznanie cytologiczne określa jedynie charakter procesu (zapalny, nowotwór złośliwy, niezłośliwy.

Rozmaz jest niediagnostyczny z powodu:

- małej liczby komórek,

- licznych artefaktów,

- dużej ilości krwi,

-obfitego nacieku limfocytarnego.

Metody barwienia rozmazów cytologicznych:

- May- Grunwalda-Gimesy,

- Papanicolaou,

- Wrighta,

- barwienie hematoksylina-eozyna.

Biopsja gruboigłowa (LNAB large Needles aspiration biopsy)- polega na wprowadzeniu specjalnej igły bioptycznej do tkanki i pobrania jej cylindrycznego wycinka, który następnie poddawany jest rutynowej obróbce histopatologicznej. Do tego celu stosuje się różne typy igieł biopsyjnych o średnicy powyżej 1,2 mm, ostro zakończonych, wewnątrz posiadających mandryn z wypełnieniem (służy do wycięcia z miąższu guza podłużnego fragmentu). Przy stos. biopsji gruboigłowej potrzebne jest znieczulenie miejscowe lub ogólne. Miejsce nakłucia należy wygolić i odkazić jak przy przygotowywaniu pola operacyjnego. W przypadku użycia igieł typu „Tru-cut” w miejscu wkłucia należy wykonać wcześniej skalpelem niewielkie nacięcie skóry (dł………..).

Sposób wykonania biopsji:

1. Znieczulenie miejscowe skóry wokół miejsca wkłucia (lidokainą).

2. Przyciśnięcie trepanu do skóry i obracanie w jednym kierunku.

3. Wycięcie wolnego fragmentu tkanki, który powstał po cięciu trepanem.

4. Ułożenie wyciętego fragmentu na kartce z zaznaczeniem kierunku wzrostu włosów, utrwalenie w 10% zbuforowanej formalinie i przesłanie do laboratorium.

Komplikacje są rzadkie, czasem może wystąpić niewielkie krwawienie lub deformacji tkanek. Miejsce po biopsji goi się przez ziarninowanie.

Biopsja chirurgiczna – polega na usunięciu całego guza (całkowita) lub jego fragmentu (częściowa) z zastosowaniem procedury chirurgicznej.

• Biopsja chirurgiczna całkowita – usunięcie guza w całości z niewielkim marginesem otaczających tkanek zdrowych (biopsja wycięciowa), lub śródoperacyjnego całkowitego usunięcia guza zmiany lub zmienionego narządu (biopsja otwarta).

• Biopsja chirurgiczna częściowa – polega na pobraniu tylko niewielkiego fragmentu zmienionej tkanki (biopsja wycinkowa). Cięcie powinno obejmować fragment guza i fragment tkanki zdrowej. Istnieje wiele odmian biopsji wycinkowej, począwszy od małych wycinków ze skóry, poprzez biopsje endoskopowe (wycinki pobieramy różnego rodzaju kleszczykami) aż do zabiegu operacyjnego.

Dzięki zastosowaniu biopsji chirurgicznej można postawić ostateczne rozpoznanie odnośnie charakteru zmiany, określenie stopnia złośliwości oraz typu histopatologicznego komórek, w przypadku zmian o charakterze nowotworowym wraz z linią cięcia. Biopsja częściowa jest często stosowana gdy istnieje możliwość przeprowadzenia tzn. badania śródoperacyjnego, co uwarunkowane jest bliskim sąsiedztwem pracowni histopatologicznej. Wówczas stosuje się metodę mrożeniową krwi i w ciągu kilkunastu minut uzyskuje się rozpoznanie histopatologiczne, co umożliwia kontynuację zabiegu chirurgicznego.

Nekropsja

To pośmiertne pobranie wycinków tkanek i innych prób przeznaczonych do badania laboratoryjnego, podczas sekcji zwłok padłego zwierzęcia lub badania poubojowego. Dobre prep. histopatologiczne można otrzymywać jedynie z materiału świeżego, dlatego wycinki trzeba pobrać możliwie zaraz po śmierci i utrwalić w płynie utrwalającym.

Pobieranie materiału do badań histopatologicznych

- Od małych zwierząt (szczur, mysz) pobiera się narząd w całości, bez względu na rozległość zmian.

- Od dużych zwierząt z narządów miąższowych (np. wątroby, nerek, serca) pobiera się wycinki w kształcie graniastosłupów o grubości do 2 cm. Wycinki pobiera się ostrym nożem, skalpelem, wykonując cięcia zdecydowane, bez piłowania, szarpania i nadmiernego pociągania. Można posługiwać się szczypczykami anatomicznymi, unikając chirurgicznych i innych narzędzi miażdżących. W przypadku narządów o budowie rurowej (macica, jelita, naczynia krwionośne, tchawica) wycinki powinny zawierać wszystkie warstwy danego narządu (bł.śluz, warstwą podśluz., mięśniową, surowiczą). Do pobrania narządów rurowych można również używać ostrych nożyczek. Pobiera się wówczas nieco większe wycinki, które należy rozprostować i zanurzyć w płynie utrwalającym.

- Częstym błędem jest pobierania zbyt dużych wycinków tkanek, co utrudnia ich wielkość i wcale nie ułatwia rozpoznania!

- Niektóre narządy i tkanki szybko ulegają autolizie, np. mózg, trzustka, bł.śluz. pęcherzyka żółciowego, macica przy ropomaciczu, łożysko, dlatego wycinki tych narządów powinny być pobrane jak najszybciej po śmierci. Pęcherzyk żółciowy należy naciąć tak by płyn utrwalający działał bezpośrednio na bł.śluz., podobnie należy postępować w przypadku macicy.

Wysyłanie materiału do pracowni histopatologicznej:

W tym celu należy:

1. Przygotować odpowiedni pojemnik/słoik, w którym zostanie umieszony utrwalaczi badana tkanka.

2. Pamiętać by słoik miał odpowiednią wielkość i szeroką szyjkę, co ułatwi wkładanie i wyjmowanie wycinków po utrwaleniu, ponieważ w czasie utrwalanie objętość tkanek zwiększa się.

3. W pierwszej kolejność wlać do słoika płyn utrwalający, a następnie umieścić wycinki. Postępując odwrotnie możemy doprowadzić do autolizy i gnicia tkanek, mimo obecności płynu utrwalającego. Tkanki włożone do słoika przykleją się do ścianki, co uniemożliwi penetrację utrwalacza.

4. Słoik odpowiednio oznakować, bo jest szczególnie ważne przy przesyłaniu dużej ilości prób. W tym celu należy przykleić etykietę samoprzylepną zawierającą odpowiednią informację lub włożyć do słoika kartkę napisaną ołówkiem.

5. Do każdej przesyłki dołączyć pismo przewodnie, w którym należy podać:

• Rodzaj przesyłanych próbek,

• Opis zwierzęcia,

• Nazwisko i adres właściciela zwierzęcia,

• Opis zmian makroskopowych,

• Rozpoznanie kliniczne,

• Wyniki badań dodatkowych (laboratoryjnych),

• Zastosowane leczenie i jego skuteczność,

• Kierunek badania histopatologicznego.

1. Umieścić słoik z pismem przewodnim w kartonowym pudełku wypełnionym ścinkami gazet lub styropianem.

2. Wysłać osobiście lub przez firmę kurierską do laboratorium histopatologicznego.

W przypadku gdy laboratorium znajduje się daleko i nie ma możliwości wysyłki prób w pojemnikach, można stosować woreczki foliowe. W tym celu wycinki na miejscu utrwalamy w słoiku z płynem utrwalającym, następnie tkanki zawijamy w gazę lub ligninę nasączoną 10% roztworem formaliny i wkładamy do woreczka foliowego lub rękawicy gumowej i wraz z pismem przewodnim wysyłamy do laboratorium.

Techniki uzyskiwania preparatów histopatologicznych:

1. Parafinowa

2. Mrożeniowa.

Technika parafinowa – jest czasochłonna, przeciętnie preparaty uzyskuje się po 5-6 dniach od chwili pobrania materiału do badań!!! Zaletą tej metody jest uzyskiwanie preparatów dobrej jakości.

Etapy przygotowania preparatów techniką parafinową:

1. Utrwalanie preparatu.

2. Płukanie.

3. Odwadnianie.

4. Prześwietlanie.

5. Przepajanie wycinków parafiną.

6. Zatapianie w bloczki parafinowe.

7. Krojenie.

8. Naklejanie na szkiełka podstawowe.

9. Barwienie

10. Przykrywanie szkiełkiem nakrywkowym i wykańczanie preparatu.

1. Utrwalanie ma na celu:

- szybkie ustalenie komórek i tkanek w takim wzajemnym położeniu, w jakim znajdowały się za życia lub w chwili śmierci,

- ścięcie białek, ustalenie składników wewnątrzkomórkowych i nadanie im cech nierozpuszczalności,

- zatrzymanie procesu autolizy i gnicia wywołanej działaniem enzymów wewnątrzkomórkowych i bakterii, również unieszkodliwienie zarazków,

- zróżnicowanie współczynników załamania światła między poszczególnymi częściami komórki,

- utrudnienie procesów osmozy i innych procesów chemicznych zmieniających obraz tkanek.

Zasady utrwalania tkanek:

- utrwalanie powinno być szybkie,

- objętość płynu utrwalającego powinno być 10-20 razy większe niż tkanki,

- płyn utrwalający należy wlać do słoika przed włożeniem tkanki,

- preparaty utrwalamy w temp.pokojowej (1-5 dni w zależności od wielkości wycinka). Formalina, która jest najczęściej stosowanym utrwalaczem penetruje 6-9 mm tkanki/ dobra w temp.pokojowej,

- niskie temp.spowalaniają proces utrwalania,

- w celu przyspieszania utrwalania ogrzać próbkę w temp. 40-50 stopni (np. w cieplarce) wówczas utrwalanie trwa .........min.

- zbyt długie utrwalanie uniemożliw wykonanie niektórych badań, m.in. oznaczeń immunohistochemicznych. Po wpływem np. formaliny, w przypadku zbyt długiej ekspozycji, powstają w tkance wiązania aldehydowe (tzn. mostki poprzeczne), które maskują epitopy antygenów, przez co dochodzi do zmniejszenia antygenowości tkanek. Mostki te można zerwać przez dwukrotne gotowanie w mikrofalówce (650W), w buforze cytrynowym o pH 6,0.

Płyny utrwalające:

1. Proste:

- kwasy organiczne i mineralne, np. kwas osmowy, chromowy, octowy, azotowy, pikrynowy,

- związki organiczne, np. aceton, formalina, alkohole,

- roztwory soli metali ciężkich, np. azotan srebra, dwuchromian potasu, sublimat.

2. Złożone:

- płyn Bouina składający się z wodnego nasyconego roztworu kwasu pikrynowego, formolu i kwasu octowego lodowego,

- płyn Zenkera składający się z wody destylowanej, chlorku rtęci, dwuchromianu potasu, siarczanu sodu i kwasu octowego lodowego.

Formalina – wodny nasycony roztwór aldehydu mrówkowego (inaczej formaldehydu lub metanalu), jest najpopularniejszym płynem utrwalającym. Najczęściej stosuje się roztwór 10%, zbuforowany o pH 7,0-7,2.

Sposób przygotowania 10% roztworu formaliny zbuforowanej:

100 ml formaliny odczynnikowej cz.d.a. + 900 ml wody (najlepiej destylowanej) + 3,4 g NaH₂PO₄ + 6,5g Na₂HPO₄

Po utrwalaniu preparatu wycinamy z niego fragmenty o grubości ok. 2 mm i wielkość 0,5cm/0,5cm, najlepiej z pogranicza zdrowej i chorej tkanki oraz ze środka zmiany.

Każdy fragment umieszczamy w specjalnym koszyczku, w którego przegródki wcześniej wkładamy karteczki z numerami. Od tego momentu każdy fragment tkanki ma przyporządkowany sobie numer, który wraz z pozostałymi informacjami dotyczącymi materiału odnotowuje się w miejsce badań histopatologicznych.

2.Płukanie preparatów:

Wykonuje się w calu usunięcia płynów utrwalających. Po zamknięciu koszyczki wraz z preparatami umieszcza się w słoiku i stawia pod mały strumień bieżącej wody na 30-60 min.

3.4.Odwadnianie i prześwietlanie:

Odbywa się w specjalnych automatycznych urządzeniach laboratoryjnych zwanych autotechnikonami.

- odwadnianie – czyli pozbawianie wody odbywa się w tzn. szeregu alkoholowym, tj. o wzrastającym stężeniu, np. 50%, 80% i 95% alkohol absolutny. Czas zależy od wielkości i grubości wycinka, średnio wynosi 12h.

- prześwietlanie – odbywa się przez umieszczenie preparatów kolejno: w mieszaninie alkoholu absolutnego i ksylenu oraz dwukrotnie w pojemnikach z ksylenem. Prześwietlenie ma na celu przygotowanie preparatów do kolejnego etapu jakim jest zatapianie w parafinie. Ksylen jest bowiem płynem który głęboko penetruje tkanki i w ten sposób toruje drogę parafinie, która dodatkowo rozpuszcza się w nim, etap ten trwa ok. 12h.

5.Przepajanie wycinków parafiną:

Odbywa się w cieplarkach w temp.ok.56st. Każdy preparat wyjmuje się z koszyczka z przypisanym jemu numerem i umieszcza się w porcelanowych tygielkach początkowo w mieszaninie parafiny i ksylenu a po 3-4 godzinach przenosi się do tygielków z samą parafiną. Po 24h przebywania preparatów w cieplarce wyjmuje się je z tygielkami i przygotowuje do kolejnego etapu.

6.Zatapianie w bloczki parafinowe:

Odbywa się za pomocą miedzianych ramek, do których nalewa się płynną parafinę. Do parafiny wkłada się odpowiednio usytuowany wycinek tkanki wraz z przypisanym jemu numerkiem, ale tym razem napisanym na pasku papieru. Po zastygnięciu parafiny, blok z zatopionymi wycinkami wyjmuje się z ramek i tnie nożem na kostki, w ten sposób, że każda z nich zawiera jeden zatopiony wycinek wraz z numerkiem

7.Krojenie bloczków parafinowych:

Odbywa się przy pomocy specjalnych urządzeń – mikrotomów. Wyróżniamy mikrotomy:

- rotacyjny – w którym nóż mikrotomowy umieszczony jest w nieruchomych uchwytach, natomiast kostka umocowana jest na ruchomym stoliku, przesuwającym się prostopadle do noża i w ten sposób ścina kawałki o grubości 3-25 mikronów.

- saneczkowy – w którym bloczek parafinowy przymocowuje się do nieruchomego stolika, a nóż mikrotomowy, umieszczony na saneczkach ślizgowych, przesuwa się nad bloczkiem i ścina skrawki o grubości 3-25 mikronów.

Należy pamiętać by bloczki przeznaczone do skrojenia zostały umieszczone w lodówce w celu schłodzenia, co ułatwi proces skrajania kostek parafinowych.

W obu typach mikrotomów grubość skrawków reguluje się specjalnymi śrubami mikrometrycznymi.

8.Naklejanie na szkiełka podstawowe:

Uzyskane skrawki parafinowe są pomarszczone, należy je przenieść przy pomocy drewnianych lub metalowych pałeczek do naczynia z ciepłą wodą, umieszczonego na płycie grzewczej. W ciepłej wodzie preparaty rozprostowują się. Rozprostowane skrawki nakleja się na opatrzone odpowiednim, przypisanym danemu preparatowi, numerem, szkiełko podstawowe. Jeśli preparat ma być poddany badaniu immunohistochemicznemu, to przed nałożeniem skrawka szkiełko należy pokryć specjalnym klejem,np. silanem. Obecność kleju zwiększy fiksację skrawka na szkiełku.

Przed przystąpieniem do kolejnego etapu obróbki preparatów techniką parafinową, szkiełka podstawowe wraz ze skrawkami należy umieścić na 30 min. w cieplarce w celu pozbycia się parafiny.

9.Barwienie :

Celem badania jest zróżnicowanie poszczególnych składowych komórki i tkanki, np. zróżnicowanie cytoplazmy, lub komórek miąższowych.

Barwniki można podzielić na kwaśne, zasadowe i obojętne. Odczyn tych związków determinuje powinowactwo do odpowiednich struktur komórkowych, dlatego można mówić o barwnikach jądrowych, cytoplazmatycznych itp.

- barwniki jądrowe- (zasadowe) zalicza się hematoksylinę, błękit metylenowy, safraninę, fuksynę zasadową, zieleń malachitową i inne,

- barwniki cytoplazmatyczne – (kwaśne) zalicza się eozynę, czerwień Kongo, floksynę, fuksynę kwaśną, oranż i inne.

Niektóre barwniki rozpuszczają się tylko w określonych ciałach wewnątrzkomórkowych lub tkankach, np. tłuszczach. Do barwników tłuszczowych zalicza się Sudan I, II, III, IV, purpurę R, czerwień…….i inne.

Skrawki można barwić metodą:

-progresywną – polega na stosowaniu barwinków rozcieńczonych, przez długi okres, aż do właściwego wysyczenia barwnikiem struktur komórkowych,

- regresywną – polega na celowym przebarwianiu tkanek barwnikami stężonymi, a następnie pozbyciu się nadmiaru barwnika za pomocą płynów odbarwiających (np. Barwinie HBFP).

Podstawowe barwienia tkanek wykonywanie w pracowni histopatologicznej:

- badanie rutynowe HE- hematoksylina i eozyna,

- barwienie różnicujące tkankę łączną, np. van Gieson, Azan, Masson,

- wykrywanie włókien retikulinowych: Gomori, Gordon, Sweet,

- wykrywanie włókien sprężystych: Weigert, barwienie orceiną,

- wykrywanie ziarnistości,

- wykrywanie amyloidu w tkankach, np. barwnie czerwienią Kongo,

- wykrywanie węglowodanów i glikozaminoglikanów, np. metoda PAS wg McManusa,

- barwienie na obecność tłuszczów, np. Sudanem,

- barwienie komórek APUD: Grimeliusa, Masson-Fontana.

Barwienie immunohistochemiczne i immunocytochemiczne:

Polega na wykrywaniu określonych antygenów tkankowych lub komórkowych (jądrowych, cytoplazmatycznych) za pomocą swoistych przeciwciał (tzn. przeciwciała pierwotne). Stosuje się przeciwciała poliklonalne, skierowane przeciwko kilku epitopom danego antygenu oraz monoklonalne (bardziej swoiste i częściej używane). Uzyskuje się je wykorzystując różnych seroproducentów, np. myszy, szczuty, króliki.

Barwinie immunohistochemiczne metodą strept(avidyna)-biotyna:

1. Nakładanie na przeciwciała pierwotnego (np. mysie).

2. Nakładanie przeciwciała wtórnego biotynylowanego (np. anty-mysie).

3. Nakładanie streptawidyny (awidyny) połączonej z enzymem, najczęściej peroksydazą.

4. Nakładanie substratu, np. DAB, który w połączeniu z enzymem daje reakcję barwną.

Obecnie dostępne są zestawy, w których wtórne przeciwciała skonjugowane są z mikropolimerami bardzo aktywnych enzymów (np. ImmPRESS Universal Antibody Kit). Zastosowanie takich przeciwciał skraca znacznie czas barwienia i poprawia jakość reakcji.

Sporządzanie preparatów za pomocą mrożenia tkanek:

pozwala na szybkie pozyskanie skrawków z preparatów świeżych z pominięciem etapu utrwalania tkanek. Bloczki parafinowe zamraża się, najczęściej sprzężonym CO₂ i kroi używając specjalnych mikrotomów saneczkowych. W skrawkach uzyskiwanych metodą mrożeniową można wykrywać obecność związków chemicznych, które w technice parafinowej ulegają rozpuszczaniu przez alkohol i ksylen.