Zadanie 2. Próba benzydynowa
Materiały:
Wyciąg z ziemniaków
Odczynnik benzydynowy
Próba benzydynowa – próba służąca do wykrywania enzymu peroksydazy, która jest katalizatorem utleniania nadtlenkiem wodoru różnych substratów (tu odczynnika benzydynowego, który pod działaniem utleniaczy daje błękitny wielocząsteczkowy produkt o złożonej budowie). W obecności peroksydaz utlenianie przebiega bardzo szybko.
Wykonanie:
Do dwóch ponumerowanych probówek wlać po 1 ml wyciągu z ziemniaka.
Jedną probówkę włożyć do łaźni wodnej i zagotować wyciąg z ziemniaka, później go schłodzić.
Do wyciągu z ziemniaka w każdej probówce dodać kilka kropel świeżo przygotowanego odczynnika benzydynowego.
Wyniki:
Wyciąg z ziemniaka, który nie był uprzednio zagotowany, po dodaniu odczynnika benzydynowego zmienia barwę na granatowo – niebieską. Wyciąg z ziemniaka, który był wcześniej zagotowany i następnie schłodzony nie zmienia barwy po dodaniu odczynnika benzydynowego.
Wnioski:
W wywarze ziemniaka, który nie był wcześniej zagotowany są enzymy peroksydazy. Po dodaniu do wywaru odczynnika benzydynowego w wyniku działania peroksydaz powstaje granatowo – niebieski produkt. W probówce z wywarem, który był wcześniej zagotowany w wyniku działania wysokiej temperatury enzymy zostały zniszczone i po dodaniu odczynnika benzydynowego roztwór nie zmienia barwy.
Zadanie 3. β-amylaza z nasion zbożowych
Materiały:
Wyciąg z nasion
płyn Lugola
0,5% r-r skrobi
odczynnik Benedicta
Metody wykorzystane w doświadczeniu:
Próba Benedicta - reakcja chemiczna, która służy do wykrywania cukrów redukujących. Odczynnik Benedicta dodaje się do roztworu i doprowadza do wrzenia. Duże stężenie cukrów redukujących lub aldehydu powoduje powstanie czerwonego osadu tlenku miedzi (I), mniejsze żółtego osadu. Odczynnik Benedicta to mieszanina siarczanu (VI) miedzi (II) i przesączonej mieszaniny uwodnionego cytrynianu sodu z uwodnionym węglanem sodu.
Próba Lugola - płyn Lugola to wodny roztwór jodu z jodkiem potasu, który służy do wykrywania skrobi. Dodany do płynów zawierających skrobię zmienia ich barwę na fioletowoczarną, przy niewielkich stężeniach na niebieskofioletową.
Wykonanie:
Do 6 ponumerowanych probówek wlać po 0,7 ml wody i 1 ml r-ru skrobi.
Do probówki nr 1 dodać 0,3 ml zagotowanego i oziębionego wyciągu z nasion.
Do pozostałych dodać po 0,3 ml niezagotowanego wyciągu z nasion i wymieszać.
Probówki nr 2 nie inkubować od razu wstawić( do wrzącej łaźni wodnej na ok 5 minut)
Pozostałe probówki wstawić do łaźni o temp. 37ºC na czas podany w tabelce.
Następnie wszystkie probówki zagotować we wrzącej łaźni wodnej (ok 5 minut).
Oziębić, zawartość każdej z probówek i podzielić na 2 równe części.
W jednej przeprowadzić próbę Benedicta, a w drugiej próbę Lugola.
Wyniki:
| Numer próby | Czas inkubacji (min) | Próba Benedicta | Próba Lugola |
|---|---|---|---|
| 1 | 30 | Lazurowy roztwór | granatowe zabarwienie |
| 2 | 0 | Niebieskie zabarwienie | jasnoniebieskie zabarwienie |
| 3 | 5 | Zielono-niebieskie zabarwienie | jasnoniebieskie zabarwienie |
| 4 | 10 | Zielono-niebieskie zabarwienie | grantowe zabarwienie |
| 5 | 20 | Zielono-niebieskie zabarwienie | granatowe zabarwienie |
| 6 | 30 | Zielono-niebieskie zabarwienie | granatowe zabarwienie |
Wnioski:
Substratem tej reakcji jest enzym β-amylaza pochodząca z nasion zbożowych. Próbę Lugola wykonujemy w tym doświadczeniu, aby zbadać zawartość skrobi, natomiast próbę Benedicta, aby sprawdzić obecność cukrów redukujących w roztworze, pochodzących z rozkładu skrobi. Te probówki, które miały najdłuższy czas inkubowania powinny dać ujemną próbę Lugola, a te co najkrócej – dodatnią. Wynika z tego ,iż w probówkach najdłużej inkubowanych nie jest wykrywana już skrobia, bądź są to jej śladowe ilości. Jest to poprawne stwierdzenie, gdyż wtedy enzymy pochodzące z wyciągu z nasion miały więcej czasu na działanie i rozłożenie skrobi przed ich denaturacją po zagotowaniu. W wykonanym doświadczeniu założenia dotyczące próby Benedicta potwierdziły się. Jednak podczas wykonywania próby Lugola tylko w probówce nr 2 i 3 powstał jasny roztwór, a w pozostałych widoczne było granatowe zabarwienie, taka rozbieżność może wynikać z powodu dodania za dużej ilości płynu Lugola do badanego roztworu. Wykonane reakcje i otrzymane wyniki porównujemy z próbą kontrolną, którą w tym przypadku jest probówka nr 1. Roztwór był zagotowany bez wcześniejszej inkubacji, enzymy nie miały czasu zadziałać przed denaturacją i skrobia nie została rozłożona.