2.Odczyn barwny wiązania peptydowego – próba biuretowa.

 Reakcja biuretowa (Piotrowskiego^[1]) - charakterystyczna reakcja chemiczna otrzymywania wiązań biuretowych.

Reakcja ta odgrywa duże znaczenie przy otrzymywaniu pochodnych biuretu, zachodzi w trakcie tworzenia się pianek poliuretanowych, a także jest stosowana jako test na występowanie co najmniej dwóch wiązań peptydowych bezpośrednio obok siebie lub przedzielonych nie więcej niż jednym atomem węgla w rozmaitych związkach organicznych, głównie w białkach i innych polipeptydach. Test biuretowy polega na dodaniu do analizowanej mieszaniny roztworu fosforanu miedzi(II) lub siarczanu(VI) miedzi(II) oraz NaOH lub KOH. Przy obecności odpowiednich protein roztwór zmienia barwę z jasnoniebieskiej, wynikającej z obecności zhydratowanych jonów Cu²⁺, na intensywnie fioletowy kolor na skutek powstawania złożonych związków kompleksowych, w których jon Cu²⁺ jest kompleksowany przez minimum dwie grupy peptydowe. Test ten jest powszechnie stosowany przy sprawdzaniu obecności wolnego białka we krwi i innych płynach ustrojowych człowieka i zwierząt.

Materiały: r-r NaOH; 0,1% r-r CuSO₄; 0,5% r-ry albuminy, żelatyny, kazeiny, peptonu i glicyny; zawiesina mąki pszennej;

Czynności:

1)     do podpisanych probówek dodano osobno: 2 ml badanego r-ru białka, 2 ml r-ru glicyny i 2 ml wody destylowanej;

2)     do każdej przygotowanej probówki dodano 2 ml r-ru NaOH; po wymieszaniu dodawano kroplami 0,1% r-r CuSO₄, aż pojawiło się zabarwienie (~15 kropli);

 

Obserwacje:

1)     próbka kontrolna (z wodą) – r-r barwy błękitnej (wynik negatywny próby biuretowej);

2)     probówka z glicyną – błękitny r-r (wynik negatywny);

3)     probówki z albuminą, kazeiną, żelatyną, peptonem, mąką pszenną – fioletowy r-r (wynik pozytywny);

 

Wnioski:

1)     Roztwory kazeiny (białko mleka), żelatyny (- kolagen), albuminy (białko mleka, jaja kurzego), peptonu i mąki pszennej (- białka glutenowe) po dodaniu NaOH i CuSO₄ zmieniły zabarwienie z błękitu na fiolet, tym samym dając pozytywny wynik próby biuretowej, co wykazuje, że w/w związki zawierają wiązania peptydowe;

2)     Roztwór glicyny nie zmienił zabarwienia - jest aminokwasem, nie posiada wiązań peptydowych, ponieważ jest monomerem;

 

3. Wykrywanie wolnych grup aminowych za pomocą ninhydryny.

Ninhydryna (wodzian triketohydrindanu) – organiczny związek chemiczny powszechnie używany jako niezwykle czuły wskaźnik chemiczny do wykrywania aminokwasów i amin pierwszorzędowych (tzw. odczynnik Abderhaldena). Ninhydryna jest umiarkowanie rozpuszczalna w wodzie (1 – 5 g/dm³ w 20 °C) i alkoholach, słabo rozpuszczalna w eterze. Szkodliwa dla zdrowia. W reakcji z amoniakiem i pierwszorzędową grupą aminową aminokwasów, peptonów, polipeptydów, amin oraz innych związków zawierających grupę NH₂ tworzy barwne związki (żółte, różowe, niebieskie). Barwa produktu zależy od struktury substratu aminowego i może być wskazówką analityczną. Związek ten jest stosowany jako wskaźnik przy ilościowym oznaczaniu aminokwasów. Jest używana do wykrywania odcisków palców na papierze i powierzchniach porowatych. Aminy pierwszorzędowe w reakcji z ninhydryną wytwarzają zasadę Schiffa (iminę), która następnie w wieloetapowej reakcji rozpada się, zazwyczaj z wytworzeniem 2-amino-3-hydroksy-1H-inden-1-onu (aminokwasy w tym procesie tracą grupę aminową i ulegają dekarboksylacji do aldehydów krótszych o jeden atom węgla). Powstała pochodna aminoindenu reaguje z kolejną cząsteczką ninhydryny, tworząc kolejną zasadę Schiffa, tzw. purpurę Ruhemanna o barwie fioletowo- niebieskiej. Ninhydryna z aminami drugorzędowymi powstają sole o zabarwieniu żółto-pomarańczowym.

Materiały: 0,1% r-r ninhydryny; 0,5% r-ry albuminy, żelatyny, kazeiny, peptonu, glicyny;

 

Czynności:

1)     do podpisanych probówek dodano osobno: 2 ml badanego r-ru białka, 2 ml r-ru glicyny i 2 ml wody destylowanej;

2)     do każdej probówki dodano 0,5 ml r-ru ninhydryny i zapisano obserwacje;

3)     po podgrzaniu probówek w łaźni wodnej (5min, 95°C) zanotowano obserwacje;

 

Obserwacje:

1)     na zimno: r-r glicyny był jasnofioletowy, a reszta r-rów była prawie bezbarwna;

2)     po podgrzaniu: r-r glicyny, peptonu – ciemnofioletowy; r-ry albuminy, kazeiny i żelatyny– jasnofioletowe;

 

Wnioski:

1)     Próba w reakcji z glicyną, albuminą, żelatyną i kazeiną, peptonem dała wynik pozytywny.

2)     Reakcja ninhydrynowa służy do wykrywania aminokwasów - glicyna jest aminokwasem, a albumina, żelatyna pepton i kazeina zawierają aminokwasy, ponieważ są białkami.

3)     Podgrzanie przyspieszyło reakcję.

Początek formularza

6. Zawartość skrobi i cukrów redukujących w komórkach spichrzowych roślin.

Cukry redukujące - są to wszystkie węglowodany, które reagują pozytywnie z odczynnikiem Fehlinga, Benedicta i Tollensa. Należą do nich niektóre monosacharydy, takie jak aldozy (tzn. cukry posiadające grupę aldehydową) i ketozy (tzn. cukry posiadające grupę ketonową) oraz niektóre oligosacharydy (laktoza, maltoza). Grupa aldehydowa w reakcji z wcześniej wspomnianymi odczynnikami redukuje je, natomiast sama ulega utlenieniu do grupy karboksylowej. Zaś grupa ketonowa ulega reakcji enolizacji tworząc epimery, dwie aldozy i jedną ketozę.

Próba Benedicta – reakcja chemiczna, która służy do wykrywania większości cukrów (oprócz np. sacharozy) i aldehydów. Odczynnik Benedicta to ciemnoniebieski cytrynianowy kompleks miedzi(II) sporządzany przez rozpuszczenie w wodzie siarczanu(VI) miedzi(II)^[2], cytrynianu sodu i węglanu sodu. W porównaniu z odczynnikiem Fehlinga jest znacznie mniej zasadowy (ze względu na zastąpienie wodorotlenku sodu węglanem), bardziej czuły i bardziej odporny na substancje towarzyszące, np. kwas moczowy. Wykazuje dużą trwałość i może być przechowywany w temperaturze pokojowej przez co najmniej rok^[1].

Płyn Lugola (łac. Iodi solutio aquosa) – wodny roztwór czystego jodu w jodku potasu, opracowany przez Jeana Lugola w roku 1829. Ma działanie odkażające, jest stosowany w leczeniu pewnych schorzeń tarczycy, w zależności od dawki pobudza lub hamuje czynność tego gruczołu. W postaci rozcieńczonej (kilka kropel na 100 ml wody) ma zastosowanie jako antyseptyk do płukania gardła^[1]. Poza medycyną, płyn Lugola służy do wykrywania skrobi. Dodany do płynów zawierających skrobię zmienia ich barwę na fioletowoczarną, przy niewielkich stężeniach na niebieskofioletową. Płyn Lugola wykorzystuje się do oceny stopnia rozkładu skrobi przy wyznaczaniu dojrzałości zbiorczej jabłek i gruszek przeznaczonych do długiego przechowywania.

Materiały: sucharek, mąka, ryż, odczynnik Benedicta, płyn Lugola;

Czynności:

1)     do 3 podpisanych probówek dodać odpowiednio: sucharek, mąkę i kilka ziarenek ryżu; do każdej dodać 2 ml wody destylowanej;

2)     probówki podgrzać w łaźni wodnej (5min, 95°C);

3)     do każdej dodać 5 kropli płynu Lugola, zanotować obserwacje;

4)     powtórzyć 1), 2), do każdej probówki dodać po 5 ml r-ru Benedicta i umieścić w łaźni wodnej na 5 min;

 

Obserwacje:

Sucharek – po dodaniu płynu Lugola r-r barwa granatowa; po dodaniu odczynnika Benedicta żółto- zielona;

Ryż – po dodaniu płynu Lugola – granatowa; po dodaniu odczynnika Benedicta – kolor niebieski;

Mąka– po dodaniu płynu Lugola – granatowa; po dodaniu odczynnika Benedicta – kolor niebieski.

 

Wnioski:

Sucharek – nie ma skrobi, za to duże stężenie cukrów redukujących;

Ryż – ma skrobię, nie ma cukrów redukujących;

Mąka – ma skrobię, ma cukry redukujące.

 

Dół formularza