I.Metody określania liczby drobnoustrojów:
-metody bezpośrednie(polegają na bezpośrednim liczeniu drobnoustrojów pod mikroskopem; różnice pomiędzy poszczególnymi mikroskopowymi metodami liczenia sprowadzaja sie do roznych sposobow przeliczania liczby Komorek widzianych w polu widzenia mikroskopu na jednostke masy lub objętości badanego materialu.)
bezpośrednie liczenie w preparacie barwionym
oznaczanie liczby komórek w hemocytometrze Thoma lub Bürkera
metoda filtrów membranowych (ultrafiltracji)
-metody pośrednie(nie liczy się Komorek drobnoustrojów, lecz ich populacje po wyhodowaniu na podłożu płynnym lub na stałym).
metoda posiewu powierzchniowego (rozcieńczeń probówkowych z wysiewem na płytki Petriego)
metoda posiewu głębinowego (płytek lanych)
metoda nefelometryczna (chemiczna) –skala Mc Farlanda
metoda spektrofotometryczna
II. Liczenie metodą Breeda: na powierzchni szkiełka przedmiotowego dokladnie odtłuszczonego rozprowadza się znaną objętość zawiesiny. Po wykonaniu rozmazu, utrwaleniu i zabarwieniu preparatu liczy sie pod mikroskopem srednia liczbe Komorek w trzech preparatach przygotowanych z tej samej zawiesiny a w każdym preparacie oblicza sie srednia z 20 przypadkowa dobranych pól widzenia. z otrzymanych wyników oblicza się średnia arytmetyczna liczby Komorek w polu widzenia. mikrometrem okularowym mierzy sie promien pola widzenia danego układu optycznego i oblicza się powierzchnie pola widzenia. Znając powierzchnie preparatu na szkiełku oblicza sie zawartość mikroflory w objętości zawiesiny naniesionej na szkiełko
III. Metody wskaźnikowe- informują o ogólnym stopniu zakażenia środowiska i o aktywności mikroflory. metodami tymi określa się obecność niektórych grup drobnoustrojów występujących nawet w niewielkich ilościach, ale wskazujących na stan sanitarny surowca lub produktu, a jednocześnie trudnych do hodowania metodami płytkowymi. Do wskaźnikowych należą: oznaczanie miana coli, bacillus mesentericus, miana enterokoków, wykrywanie obecności beztlenowców oraz próby reduktazowe. ilość drobnoustrojów można określać przez: pomiar objętości odwirowanego osadu drobnoustrojów, oznaczanie zawartości azotu w biomasie, pomiar światła rozproszonego przez zawiesinę drobnoustrojów, pomiar światła zaabsorbowanego
IV. Wpływ czynników fizycznych i chemicznych na drobnoustroje:
podział drobnoustrojów ze względu na ich stosunek do tlenu, wrażliwość na temperaturę, tolerancję na pH: Istotny wpływ czynników zewnętrznych na drobnoustroje i ich wzajemne oddziaływanie, ponieważ: duża powierzchnia drobnoustrojów w stosunku do masy, niewielka „elastyczność” wewnątrzkomórkowych układów regulacyjnych metabolizmu, zdolność do wytwarzania przetrwalników, możliwość przemieszczania się w odpowiedzi na bodziec zewnętrzny
Efekt działania czynników zewnętrznych na drobnoustroje zależy od: natężenia, czasu działania, gatunku (a nawet szczepu) drobnoustrojów
Rodzaje oddziaływania czynników zewnętrznych na drobnoustroje: statyczne – hamujące namnażanie się drobnoustrojów, zabójcze (nieodwracalne) – prowadzące do utraty zdolności wzrostu, namnażanie się i śmierci
1.Woda – wysuszenie:
-wilgotność poniżej 30% zawartości wody w środowisku hamuje wzrost bakterii (wzrost grzybów ustaje przy zawartości wody poniżej 15%)
-najbardziej wrażliwe są: krętki, zarazki rzeżączki, pałeczki grypowe, pałeczki Gram-ujemne); bakterie Gram-dodatnie są mniej wrażliwe od bakterii Gram-ujemnych
-najbardziej odporne są bakterie z rodzaju Mycobacterium – posiadają ścianę komórkową zbudowana z wielu warstw lipidów lub ich pochodnych
-endo- i egzospory, zarodniki glonów i grzybów są bardziej odporne niż formy wegetatywne
-otoczki zwiększają odporność na wysychanie
Rodzaje sterylizacji:
• sterylizacja wysokotemperaturowa(bieżącą para wodna, para wodna w nadciśnieniu, suche gorące powietrze, promieniowanie podczerwone)
• sterylizacja niskotemperaturowa(tlenek etylenu, promieniowanie jonizujące, formaldehyd, plazma gazu)
Pasteryzacja - jest to proces działania na drobnoustroje temperaturą do 100°C. Pasteryzację pożywek prowadzi się w aparatach Kocha, w którym czynnikiem wyjaławiającym jest bieżąca para wodna o temperaturze około 100°C. Wyjaławiany materiał ustawia się na ażurowych półkach. Czas pasteryzacji zależy od objętości i rodzaju wyjaławianego materiału i wynosi 15-60 minut. Podczas tego procesu niszczą się tylko formy wegetatywne drobnoustrojów, nie niszą się formy przetrwalne.
Tyndalizacja - jest to proces trzykrotnej pasteryzacji (100°C przez 30 minut) przeprowadzanej w odstępach co 24 godziny w celu pełnego wyjałowienia pożywek. W przerwach między wyjaławianiem podłoże umieszcza się w cieplarce w temp. 32°C. W pierwszej fazie giną formy wegetatywne. Tyndalizacja prowadzi do pełnej jałowości- niszczy formy wegetatywne i przetrwalne drobnoustrojów.
Krzywa logarytmicznego namnażania drobnoustrojów: liczba komórek zwiększa się w każdym przedziale czasowym pewną ilość razy określoną przez stały czynnik. tn typ wzrostu nazywamy wzrostem logarytmicznym. Proces wzrostu drobnoustrojów w czasie można przedstawić za pomocą krzywej wzrostu bakterii. W określonych warunkach hodowli, krzywa wzrostu bakterii jest charakterystyczna dla danego gatunku. Na wykresie można wyróżnić 4 fazy:
Faza pierwotnego zahamowania (spoczynkowa, adaptacyjna)- okres początkowy po dostaniu się jednostki tworzącej kolonię np. komórki bakteryjnej, do nowego środowiska.
Faza wzrostu wykładniczego (intensywnego wzrostu)- liczba komórek gwałtownie rośnie, zachodzą intensywne podziały. Faza ta jest nazywana trofofazą.
Faza równowagi - dochodzi do zrównania się w przybliżeniu liczby komórek tworzących się i obumierających w danej chwili. Faza ta następuje gdy zaczynają się wyczerpywać źródła pokarmu i/lub stężenie produktów przemiany materii wzrasta do poziomu szkodliwego dla samych bakterii. Etap ten nazywa się czasem idiofazą.
Faza wymierania (spadkowa)- dominują procesy obumierania komórek, bakterie wytwarzają formy inwolucyjne (zmienia się kształt komórek). Drobnoustroje przetrwalnikowe intensywnie wytwarzają przetrwalniki.
Tłuszcze (lipidy) –grupy lipidów, estrów glicerolu i kwasów tłuszczowych, głównie triacylogliceroli. Reszty kwasowe występujące w cząsteczkach tłuszczów zawierają zwykle od 12 do 18 atomów węgla. tłuszcze proste(tłuszcze właściwe, woski,); tłuszcze złożone( fosfolipidy, glikolipidy), lipidy wtórne m.in. sterole, karotenoidy, węglowodany. Ze względy na pochodzenie tłuszcze właściwe dzielimy na:
roślinne – na ogół ciekłe zawierają nienasycone kwasy tłuszczowe m.in. linolenowy – nasiona rzepaku, linolowy – nasiona soi, słonecznika, oleinowy – najczęściej występujący.
zwierzęce – na ogół stałe zawierające nasycone kwasy tłuszczowe tj. kwas stearynowy, kwas palmitynowy.
Rozkład tłuszczy właściwych przez drobnoustroje obejmuje:
hydrolizę karboksylowych wiązań estrowych i uwalnianie kwasów tłuszczowych oraz glicerolu,
oksydację (utlenianie) kwasów tłuszczowych.
Drobnoustroje lipolityczne:
Bakterie: Bacillus, Pseudomonas
Drożdże: Candida (Candida cylindracea – na skalę przemysłową)
Pleśnie: Penicillum (Penicillum cyclopium), Aspergillus, Rhizopus (Rhizopus arrhizus – na skalę przemysłową)
Enzymy lipolityczne, obejmują:
lipazy – hydrolazy estrów glicerolowych,
esterazy – enzymy hydrolizujące estry innych niż glicerolu i alkoholi.
Zastosowanie: produkcja detergentów (jako dodatek), przemysł garbarski (w garbowaniu skór), przemysł mięsny, przemysł owocowo – warzywny i perfumeryjny. modyfikacja tłuszczu naturalnych (produkcja margaryny, masła kakaowego, tłuszczów do pieczenia), synteza estrów.
Lignina (drzewnik) – jeden z podstawowych składników drewna (obok celulozy i hemiceluloz), w którym występuje w ilości ok. 20%. Jest substancją lepiszczową, powodującą zwartość struktury komórek drewna. Nadaje drewnu wytrzymałość na ściskanie i utrzymuje jego sztywność. Eliminacja ligniny z drewna prowadzi do zmiękczenia substancji drzewnej, co jest procesem niezbędnym podczas produkcji papieru. Lignina jest polimerem, którego monomerami są związki organiczne będące pochodnymi alkoholi fenolowych. Są to alkohol koniferylowy, alkohol synapinowy, alkohol kumarylowy. Struktura chemiczna ligniny jest usieciowana wiązaniami eterowymi i kowalencyjnymi węgiel-węgiel (C−C).
Rozkład ligniny: Rozkład ligniny przeprowadzają grzyby, poprzez wytworzenie białej lub brunatnej zgnilizny. Najbardziej typowymi monomerycznymi produktami rozkładu ligniny są wanilina i kwas wanilinowy. Lignina jest jednym z ważnych źródeł aromatycznej części kwasów huminowych gleb, torfów, lignitów i węgli. W wyniku niepełnego rozkładu ligniny następuje wzbogacenie gleby również w związki azotowe.