Walidacja instrumentalnych metod analitycznych. Kryteria wyboru metody

Analit- składnik próbki będący przedmiotem analizy.

Matryca- pozostała część próbki, w której znajduje się analit.

Próba ślepa(próba zerowa)- próba wykonana w warunkach identycznych jak analiza badanej próbki, ale bez dodawania substancji oznaczonej.

Walidacja metody analitycznej – eksperymentalny proces oceny stopnia wiarygodności metody analitycznej prowadzony w celu zapewnienia zgodności tej metody ze stawianymi jej wymogami i sprawdzający przydatność metody do rozwiązywania określonego zadania analitycznego.

Proces walidacji prowadzi się, gdy:

• opracowywana i wprowadzana jest nowa metoda analityczna

• znana metoda analityczna jest modyfikowana w celu rozszerzenia zakresu jej stosowalności (np. oznaczanie danego analitu w innej matrycy)- zmiany w używanej metodzie

• przeprowadza się porównanie nowej metody analitycznej ze znaną metodą standardową (gdy otrzymujemy zmienne w czasie wyniki- w celach kontrolnych)

• kontrola jakości stosowanej metody stwierdziła zmienność jej parametrów walidacyjnych w czasie (gdy mamy do czynienia z nowym sprzętem lub nowymi osobami obsługującymi go)

Etapy walidacji:

1. Określenie oczekiwań do testowanej metody (matryca, rodzaje interferencji), określenie wymagań stawianych danej metodzie (wprowadzenie norm i akceptowalnych błędów)

2. Charakteryzacja metody poprzez eksperymentalne określenie parametrów:

• Dokładność metody

• Precyzję w warunkach porównywalnych (odtwarzalność) i identycznych (powtarzalność)

• Zakres metody (liniowość metody, stosowalność)

• Czułość metody

• Granice wykrywalności i oznaczalności metody

• Stabilność metody

• Specyficzność (selektywność metody)

1. Weryfikacja- porównanie etapu 1 z oczekiwaniami w 2 punkcie i sporządzenie raportu walidacyjnego (dokumentacja z etapów) na podstawie wyników uzyskanych z porównania wyników oraz oczekiwań

2. Wydanie orzeczenia walidacyjnego o użyteczności metody.

Metoda analityczna- wszystkie czynności od pobrania próbki do uzyskania końcowego wyniku za pomocą konkretnej techniki. Obejmuje wszystkie czynniki związane z wykonaniem analizy: przygotowanie próbek do analizy, pomiar, opracowanie wyników. Nie obejmuje poboru próbki- ono następuje w postępowaniu analitycznym.Sama metoda jest częścią postępowania analitycznego.Walidacji poddajemy całą metodę lub jej etapy.

Parametry metody analitycznej podlegające procesowi walidacji:

1. liniowość i zakres stosowalności metody

2. czułość

3. selektywność

4. dokładność

5. granica wykrywalności

6. granica oznaczalności

7. precyzja

8. powtarzalność i odtwarzalność

9. stabilność

10. odzysk

11. odporność na czynniki wewnętrzne i zewnętrzne

12. niepewność wyniku końcowego.

Dokładność metody- błąd względny procentowy- stopień zgodności pomiędzy wynikiem oznaczenia uzyskanym daną metodą, a wartością rzeczywistą(lub oczekiwaną).

Aby oszacować dokładność metody:

1. Przeprowadzenie analizy próbki o dokładnie znanej zawartości analitu. Używa się do tego próbek wzorcowych- certyfikowanych materiałów odniesienia (zawiera on 1 lub kilka analitów takich samych jak te w próbkach rzeczywistych), zawiera identyczną lub porównywalną matrycę- wszystkie składniki nie będące matrycą ale wpływające na wynik, stężenie ściśle określone i dołączone do certyfikatu. Na dokładność metody mają wpływ błędy systematyczne.

2. Próbkę poddajemy analizie testowaną metodą i metodą referencyjną o najwyższej możliwej dokładności oznaczeń.

3. Porównywanie wyników uzyskanych z badanej metody i z wynikami innej sprawdzonej metody.

4. Porównanie próbek przed i po wzbogaceniu (wyznacza się różnicę między nimi)- czy w toku analizy udało się nam odzyskać to co wprowadziliśmy sztucznie do próbki (znane stężenia obu probówek)= Wyznaczenie odzysku znanej ilości analitu dodanego do próbki (lub do matrycy)- wyodrębnienie analitu za pomocą ekstrakcji- najpierw analizie poddajemy certyfikowaną próbkę i dodajemy do niej znaną ilość analitu i z różnicy wyników wyliczamy wartość i wielkość odzysku.

Odzysk analitu- próbkę dzieli się na dwie równe części i do pierwszej dodaje się znaną ilość analizowanej substancji(w1). Po przeprowadzeniu całego procesu analitycznego określa się średnią zawartość analitu w próbce bez dodatku(xo) i w próbce z dodatkiem analizowanej substancji(w1)

Im większy odzysk, tym większa dokładność. Odzysk analitu powinien być w granicach: 95- 105%.

Odzysk analitu zależy od: zastosowania procedury analitycznej, rodzaju matrycy, stężenia analitu (im mniejsze tym odzysk mniejszy- z większym błędem)

$$R = \frac{C_{T} - C_{0}}{C_{W}} \times 100\%$$

C_T- stężenie wzorca

C₀- stężenie podstawowe

C_W- stężenie wzbogacone

Precyzja metody- stopień zgodności wyników uzyskanych tą samą metodą i na tej samej próbce przy wielokrotnym oznaczeniu- rozrzut wyników przy oznaczaniu składnika tą samą metodą. Im mniejszy rozrzut tym większa precyzja.

Miarą precyzji jest:

• Odchylenie standardowe- s lub δ

• Względne odchylenie standardowe- RSD

• Współczynnik zmienności CV%

Powtarzalność- gdy pomiary wykonuje jedna osoba, w tym samym laboratorium, tą samą metodą, przy tym samym urządzeniu używając tych samych próbek i odczynników oraz aparatury w krótkich odstępach czasu (np. pół godziny).

Odtwarzalność- miara zgodności wyników otrzymanych przez różne osoby, w różnych laboratoriach, różnymi odczynnikami, różna aparatura i wyposażenie, w różnych odstępach czasu przy analizowaniu tej samej próbki tą samą metodą.

Wysokość odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjna- niskie RSD mimo różnej aparatury czy osoby w 1 laboratorium

Zakres liniowości/stosowalności- przedział pomiędzy min a maks stężeniem analitu w próbce, dla których dana metoda wykazuje liniowość. Żeby go oznaczyć stosujemy krzywą kalibracyjną- możliwie szeroki zakres stężeń wzorcowych- musi się pokrywać zakres badanej próbki z dużym marginesem; wprost proporcjonalna zależność między stężeniem a sygnałem; maks stężenia- tam gdzie się zakrzywia; dolna granica zależy bezpośrednio od czułości.

Liniowość metody- zdolność do uzyskiwania wyników pomiarów, które są (bezpośrednio lub dzięki zdefiniowanym przekształceniom matematycznym) liniowo proporcjonalne do stężenia analitu w próbce w danym zakresie. Liniowość określa się na podstawie współczynnika korelacji(R²) krzywej kalibracyjnej.

Krzywa kalibracyjna- Do sporządzania krzywej kalibracyjnej stosuje się czyste wzorce analitu lub certyfikowane materiały odniesienia(CRM).

Dolna granica stosowalności metody zależy od czułości metody.

Czułość metody- nachylenie krzywej kalibracyjnej do osi stężeń, zmiana sygnału analitycznego na skutek zmiany stężenia analitu lub jego ilości. Im większe nachylenie krzywej kalibracyjnej, tym czulsza metoda.

- musi być duże α

I- czuła

II- mniej czuła

α₁ >α₂

a>tgα- miara czułości metody

y=ac+b

-odróżnienie dwóch stężeń niewiele różniących się od siebie ( Y1 a Y2- większa odległość)

-mało czułe- za mała odległość w sygnałach Y`1 i Y`2

-im bardziej czuła tym niższe stężenia można określić (tym mniejsza granica oznaczalności i wykrywalności)

-mało czuła metoda- duża różnica stężeń nie oznacza dużej różnicy między sygnałami analitycznymi

R²>0,995

R²>0,98 (analiza śladowa)- akceptowalne

Granica wykrywalności (DL, LOD)- najmniejsza ilość lub najmniejsze stężenie substancji, które może być wykryte (niekoniecznie oznaczone) za pomocą danej metody analitycznej z określonym prawdopodobieństwem. Ściśle związana z poziomem szumów stosowanego urządzenia(niepożądane sygnały do czasu pomiaru).

Y_DL= Y₀+ 3SDᴓ - jeżeli sygnał generowany przez próbkę spełnia tą zależność to spełnia granicę wykrywalności

(=C_DL- stężenie równe gr. wykrywalności- jeśli jest równe z tym wyżej)

Y₀= Y_DL- 3SDᴓ

Y_DL= a* C_DL + Yᴓ = a* C_DL + Y_DL – 3SDᴓ (skrócić trzeba i wychodzi to niżej)

C_DL = 3SDᴓ/a

Granica oznaczalności (QL, LOQ)- najniższe stężenie analitu w próbce, które można oznaczyć z daną precyzją i dokładnością. Jej wartość jest zawsze wielokrotnością wyznaczonej wartości granicy wykrywalności- najczęściej LQ=3LD- 3-krotnie wyższe od granicy wykrywalności.

Sygnał, który rejestrujemy:

Y_QL= Y₀+ 10SDᴓ (=C_QL)

Y₀= Y_QL- 10SDᴓ

Y_QL= a* C_QL + Yᴓ = a* C_QL + Y_QL – 10SDᴓ (skrócić trzeba i wychodzi to niżej)

C_QL = 10SDᴓ/a

Stosunek sygnału do szumu (w chromatografii):

$\frac{S}{N}$ - signal- to- noise ratio = średnia amplituda szumu

1. granica wykrywalności: S/N= 3 (czyli gdy wysokość jest 3x większa niż średnia amplituda szumów- da się wykryć analit w próbce)

2. granica oznaczalności: S/N= 10 (gdy wysokość jest 10x większa niż średnia amplituda szumów- da się oznaczyć analit w próbce)

1. W tym przedziale nie można powiedzieć, że analit jest w próbce; stężenie analitu jest za małe aby go wykryć (ale nie mówimy, że go nie ma wcale- czułość może być zła)- stężenie analitu w próbce poniżej granicy wykrywalności

2. Stężenie analitu w próbce jest poniżej granicy oznaczalności metody- stężenie analitu w zakresie wykrywalności metody

3. Zakres oznaczalności (stosowalności) metody.

Stabilność metody- metoda powinna być odporna na pewne niewielkie zmiany czynników zewnętrznych i wewnętrznych (wyniki muszą być porównywalne):

- celowo zmieniamy parametry i sprawdzamy jak to działa na wynik

- sprawdzanie stabilności odczynników

Specyficzność metody- gdy jedyny sygnał analityczny daje analit (idealna selektywność; brak interferencji):

- w każdych warunkach wykrywamy i oznaczamy składnik

- im większa interferencja tym mniejsza selektywność

Selektywność metody- zdolność metody do oznaczenia analitu w obecności składników matrycy w złożonej próbce rzeczywistej, bez interferencji ze strony składników towarzyszących. Metoda jest idealnie selektywna(czyli specyficzna) gdy w złożonej mieszaninie sygnał analityczny jest generowany wyłącznie przez analit.

Specyficzność – idealna selektywność

Kryteria wyboru metody analitycznej:

1. Właściwości fizykochemiczne analitu

2. Selekcja negatywna- wybór spośród pasujących metod tej najbardziej selektywnej

3. Stan skupienia próbki- inna metoda może być zbyt mało czuła by wyłapać stężenie

4. Czułość metody

5. Selektywność i specyficzność metody

6. Rząd stężeń- jeśli jest roztworem

7. Cena- jednostkowy koszt analizy jest mniejszy im więcej próbek się oznacza tą metodą