14.10.2015 – Wykład – Techniki in vitro

Kolokwium z materiału wykładowego

Zastosowanie kultur in vitro w produkcji roślin ozdobnych.

Kultury ‘in vitro’ (kultury tkankowe)

Asceptyczne kultury fragmentów roślin prowadzone w ściśle kontrolowanych warunkach.

Podstawą rozmnażania roślin w kulturach in vitro jest naturalna zdolność roślin do rozmnażania bezpłciowego oraz zdolności totipotencjalne komórek.

Totipotencja komórek roślinnych - Nieograniczona zdolnośc komórek do dzielenia się oraz odtwarzania poszczególnych organów i regeneracji całego organizmu.

Początki kultur in vitro

• 1902 r. – doświadczenia nad kulturami izolowanych komórek i tkanek roślinnych

• 1936 r. – odkrycie auksyny IAA (bardzo mało stabilna)

• Lata 30te i 40te – kultury kalusa (tkanka przyranna powstaje gdy roślina zostaje zraniona)

• 1939 r. – pierwsze kultury roślinne z tkanki rakowe Nicotiana tabacum (White) oraz z tkanki kalusowej Daucus carota.

• Lata 50te – kultury merystemów – odwirusowywanie roślin; zainicjowane przez Morel’a w 1951

• 1956 – odkrycie cytokininy – kinetyny (dość słaba cytokinina)

• 1958 – zarodki somatyczne w kulturach zawiesinowych Daucus carota

• 1962 – opracowanie składu uniwersalnej pożywki do kultur komórek, tkanek, organów roślinnych (Murashige i Skoog) – pożywka MS

• 1965 – opracowanie metody rozmnażania storczyków in vitro (opracował pożywkę do rozmnażania storczyków)

Zalety kultur tkankowych

• Nieduża ilość materiału roślinnego potrzebna do założenia kultury

• Bardzo wysoki współczynnik rozmnażania (z 1 rośliny matecznej = nawet 1 milion roślin w ciągu roku, np. lilie, storczyki)

• Zdrowy, wyrównany genetycznie i fenotypowo materiał

• Całoroczna produkcja, niezależna praktycznie od sezonu wegetacyjnego

• Łatwość międzynarodowego obroty i transportu (mała waga, czysty, wolny od patogenów materiał)

Możliwości zastosowania kultur tkankowych

• Szybkie rozmnażania w wprowadzenie na rynek nowych odmian

• Klonowanie odmian heterozygotycznych

• Odwirusowywanie – kultury izolowanych merystemów

• Wykorzystanie w inżynierii genetycznej

• Zachowanie linii męskosterylnych, uzyskiwanie form haploidalnych, tetraploidalnych, fuzje protoplastów, mieszańce somatyczne

• Długoterminowe przechowywanie cennego materiału roślinnego, banki genów

• Pozyskiwanie wtórnych metabolitów

• Produkcja zarodków somatycznych i sztucznych nasion

• Mechanizacja i automatyzacja produkcji (bioreaktory)

• Produkcja materiały roślinnego na bardzo dużą skalę – „fabryki roślin”

Produkcja globalna mikrosadzonek

W 2011 r produkcja wynosiła 863 mln (w tym 90% roślin rozmnażanych in vitro to ROŚLINY OZDOBNE).

Roczna produkcja mikrosadzonek w laboratoriach in vitro (mln szt

Europa – ok 200

USA – ok. 110

Indie – około 130

Europa i USA – ok. 70% - rośliny ozdobne

Ok. 10-15% - rośliny drzewiaste

Europa – poniżej 1% warzywa

USA - około 10% warzywa

Największy % produkcji roślin in vitro w Europie.

LABORATORIA KOMERCYJNE

Polska na 1 miejscu w produkcji roślin in vitro

POLSKA

1995 I miejsce w Europie pod względem wielkości produkcji

Wielko ść produkcji 70 – 100 mln sztuk orocznie z czego 80% eksportowane jest do Holandi, Anglioi, Hiszpani Izraela i wielu innych krajów

Czynniki wpływające na opłacalność produkcji roślin in vitro

• Duzy popyt na materiał mnożony metodą in vitro

• Warunki klimatyczne

• Koszty transportu

• Doświadczenie i wykształcenie pracowników

• Koszty robocizny (średnio 40% kosztów ogólnych)

• Koszty materiałowe (średnio 19% kosztów ogólnych)

Podsumowanie

• Zapotrzebowanie na materiał wysokiej jakości powoduje iż popyt na sdzonki roślin ozdonuch ex vitro zwiększa się na całym świecie

• Wielkość światowej produkcji metodą mikrorozmnażania w 2010 roku osiągnęła ponad 2000 mln sztuk. Około 78 – 90% stanowiły rośliny ozdobne

• Obecnie w Polsce działa około20 latoratoriów komercy……

Laboratorium kultur tkankowych

1. przygotowaniae szkła i pożywek

2. Pokój do pracy w warunkach sterylnych

3. Pokój do wzrostu kultur

4. Mycie i przechowywanie szkła – może być wydzielone lub może sąsiadować

5. *chłodnia

6. *pokój do obserwacji

7. Pomieszczenia socjalne

28.10.2015

Praca sterylna – przy stołach najczęściej I lub II klasy bezpieczeństwa

Autoklaw – urządzenie ciśnieniowe, po zwiększeniu ciśnienia o 1 bar – temp wzrasta do 121 st. C, o 2 bar – 144 stopnie .

Zasady pracy w laborat kultur tkankowych

1. Zawsze noś fartuch lab

2. Zabronione jest wnoszenie okryć wierzchnich do lab

3. W lab nie wolno spożywać jedzenia i napojów

4. Wszelkie prace odbywają się na stole z laminarnym przepływem powietrza uprzednio odkażonych 75% alkoholem etylowym

5. Narzędzia (skalpele i pincety) odkażane są w sterylizatorach kulkowych przez co najmniej 15 sek.

6. Nigdy nie trzymaj rąk bezpośrednio nad otwartym słoikiem/pojemnikiem z pożywką.

7. Zdjęte przykrywki/wieczka/zakrętki powinny być umieszczone na stole wnętrzem/wewnętrzną stroną do góry.

8. Zakrętki/słoiki powinny być odkręcone takkrótko jak to tylko możliwe

9. Zaczynając prace zawsze odkażaj blat stoły i ręce 75% alkokolem etylowym

10. Zawsze odkażaj ręce alkoholem gdy chociażby na chwilę wystawiasz je poza stół z laminarnym przepływem powietrza

11. Wszelkie narzędzia powinny pozostać na stole podczas pracy

12. Staraj się pracować nie na krawędzi stoły lecz trochę ‘głębiej’ tak by praca nawiewu była bardziej efektywna.

13. Nigdy nie stawiaj niczego między stanowiskiem swojej pracy a nawiewem

14. Staraj się nie rozmawiać podczas pracy

15. Zawsze etykietuj słoiki/probówki tak by można było zodentyfikować kiedy i co zostało wyłożone na pożywkę (data, gat. Odm., kombinacja, rodzaj pożywki

16. Po skończonej pracy posprzątaj swoje stanowisko i odkaź stół 75% alkoholem etylowym.

Etapy rozmnażania

(kultyru pąków wierzchołkowych i kątowych)

• Stadium inicjalne (Eksplantaty inicjalne: wierzchołki pędów)

• Namnażanie pędów

• Ukorzenianie pędów

• Aklimatyzacja

Rozmnażanie rośłin w kulturach tkankowych

• Rozmnażanie pąków wierzchołkowych i merystemów

• Kultury pąków pątowych

• Kultury pędów przybyszowych

• Embriogeneza somatyczna