Wykład 1

Podział genomu

Metody badań

• DNA nieamplifikowany (sondy molekularne)

  • hybrydyzacja

  • hybrydyzacja immobilizowanego DNA (nylon, nitroceluloza)

    • FISH (in situ)

    • BLOTTY N i S (białka), E (cukry, lipidy), W (immunologiczny)

• DNA amplifikowany (klonowanie, PCR)

PCR

• screeningowe

  • PCR – HD

  • PCR – SSCP

  • PCR – DGGE

  • PCR – CCM

  • PCR – PTT (sekwencjonowanie)

• do identyfikacji

  • PCR – RFLP

  • PCR – ASO

  • PCR – ARMS

  • PCR – OLA

Budowa mRNA

• CAP

  • metyloguanozyna

  • stabilizuje 5’ UTR

  • miRNA hybrydy – regiony regulujące

• Ogon POLI A

  • region regulujący 3’ UTR

  • lokalizacja subkomórkowa

Splicing

• sekwencje graniczne intron/egzon

• kompleksy snRNA i białek snRNP

• 100 różnych białek RNP

snRNP

• bierze udział w modyfikacji posttranslacyjnej RNA

• wycina introny

• snRNA, które wchodzi w jego skład jest podobne do rybosomalnego RNA i rozpoznaje swoiste sekwencje intronów

Obróbka posttranslacyjna i replikacja DNA

miRNA, snRNA, snoRNA, RNAazaP, telomeraza RNA

Wykład 2

Interferencja RNA

DICER

• endorybonukleaza (RNAaza klasy III)

• zawiera dwie domeny RNAazy III i jedną domenę PAZ

• tnie długie dsRNA, RNA wirusowe i pre miRNA do siRNA

• powoduje powstanie RISC

• aktywny jako dimer

• mutacje w genie DICER powoduje zaburzenie regulacji tworzenia się komórek zdrowych genetycznie i ma związek z patogenezą nowotworów

RISC

• zawiera jednoniciowe siRNA – SLICER

• helikaza ATP – zależna

• używa miRNA lub siRNA jako wzór do rozpoznania komplementarnego mRNA i jak je znajdzie to tnie

• jako rdzeń białko Argonautów (Ago2), które posiada funkcję katalityczną – może degradować mRNA – zapobiega translacji

• domeny PAZ 3’, PIWI 5’

• ma znaczenie w regulacji ekspresji genów i ochronie przed wirusami

miRNP

• takie coś jak RISC, tylko posiada miRNA zamiast siRNA

RNAi

• siRNA (small interfering RNA)

• miRNA (endogenne)

• rasiRNA (repeat – associated short interfering RNA)

• dsRNA

  • jest substratem dla DICERa w produkcji siRNA

  • wirusy

  • hairpin loop

RNAi działanie

• hydroliza miRNA

• represja translacji

• metylacja histonów

siRNA

• długość 20 – 25 nukleotydów (średnio 21)

• naturalne (endogenne) jako produkt działania DICERa

• można je wprowadzić do komórki w celu wyciszenia genów

• zbyt dużo siRNA aktywuje szlak interferonowy

miRNA

• naturalne jako produkt genów

• 20 – 25 bp

• transkrybowane z DNA, ale nie podlega translacji

• jak powstaje

  • gen kodujący jest dłuższy niż mRNA – zawiera sekwencję mRNA oraz odwrócony fragment komplementarny

  • odcięte czapeczka i ogon poli A

  • oba fragmenty tworzą hairpin loop

  • dsRNA –> primazy mRNA –> pri-mRNA

  • enzym Droscha (i Pascha) odcina ogonek i tworzy pre-mRNA

  • transport do cytoplazmy przez eksportynę 5

  • cięcie przez DICER na miRNA

• komplementarny do części sekwencji mRNA (fragment niekodujący 3’ UTR)

• u zwierząt miRNA zazwyczaj nie jest komplementarne do części kodujących (tak jak to jest u roślin)

• związane z 3’ UTR hamuje translację, ale nie wpływa na degradację miRNA

shRNA

• short hairpin RNA

• dostarczany przy pomocy wirusów

• lepsza selektywność niż siRNA

siRNA – ekspresja

• przejściowa – dsRNA dostarczane do komórek

• stabilna – użycie wektorów DNA do produkcji shRNA

  • nośniki – plazmidy, retrowirusy, adenowirusy

  • sposoby dostarczenia – transfekcja micelami, elektroportacja

Interakcje białko – DNA

Helix – turn – helix

• dwa skręty helisy wiążą oddzielne fragmenty białka (N i C koniec)

• domeny łączą się krótkim łącznikiem

• kolejny skręt helisy jest zaangażowany w stabilizację kompleksu

• homeodomena zawierająca 60 aminokwasów, wiążąca się z rowkiem większym DNA

• rozpoznawane 3 skręty DNA

• C – koniec jest prostopadły do utworzonego kompleksu

• rozpoznawany motyw DNA leży mniej więcej po środku homeodomeny

• homologia

• homeobox zawiera 180 nukleotydów

• geny – czynniki transkrypcyjne

• geny regulujące morfogenezę mogą być zarówno aktywatorami jak i rep resorami

• funkcja zależy od kolejnych domen

Palce cynkowe

• kilka konserwatywnych aminokwasów wiąże jony Zn (Cys, His)

• w palcu cynkowym znajduje się kilka takich domen

• występują jako dimery (TFIIA)

• występują w tandemach 1 – 9

• klasyczne białka zawierające palce cynkowe

  • receptory hormonów steroidowych

  • mineralokortykosteroidów

  • glikokortykosteroidów

  • estrogenów

  • progesteronu

  • T₃, T₄

  • witaminy D

  • kwasu retinowego

• zmienny region N – końcowy

• domena AF – 1 odpowiedzialna za konstytutywną ekspresję genów

• DNA – binding domain wraz z palcem cynkowym tworzą P – box

• linker – adaptacja białka do reszty (linking binding protein) – elementy odpowiedzi na hormony

Zamek leucynowy

• region bogaty w leucynę

• struktura helisy α

• u podstawy region zawierający aminokwasy zasadowe wiążące DNA

• dwie domeny bogate w lizynę mogą się łączyć dzięki oddziaływaniom hydrofobowym

• AP – 1 czynnik transkrypcyjny

  • heterodimer

  • ekspresja genów czynników wzrostowych GF

  • regulacja ekspresji

  • rozpoznaje sekwencję 5’ – TGAG/CTCA – 3’

• CREB (cAMP response element-binding), również czynnik transkrypcyjny

• Rozpoznawane miejsce zazwyczaj zawiera sekwencję syntetyczną bez separacji

• TRE odpowiedź na estry forbolu

Helix – loop – helix

• 40 – 45 helix

• łącznik

• w regionach hydrofobowych znajdują się fragmenty umożliwiające homodimeryzację i heterodimeryzację

HIP – hypoxia induced protein

• regulacja różnicowania, proliferacji i rozwoju

MRF (myogenic regulatory factor)

• reguluje powstawanie mięśni

• ma domenę wiążącą DNA

Wzmacniacze

• do kilku tysięcy pd od wzmacnianego genu

• regulują niespecyficznie aktywność transkrypcyjną genów lub fragmentów chromosomów

• lokalizacja względem wzmacnianego genu jest dowolna (mogą być nawet jego fragmentem)

• wiążą się z miejscami wiążącymi na czynnikach transkrypcyjnych

Wyciszacze

• podobne do wzmacniaczy

• wiążą czynniki transkrypcyjne

• hamują ekspresję genów

Izolatory

• problem transaktywacji ekspresji genu przez wzmacniacze

• krótkie fragmenty DNA zapobiegają aktywacji genu przez wzmacniacz innego genu

• CTFC (czynnik transkrypcyjny)

  • jest wrażliwy na metylację

  • rozróżnia chromosom matki od chromosomu ojca

  • metylacja jednego z chromosomów X

  • przekazywanie informacji o profilu ekspresji genów do komórek/organizmów potomnych

  • allelospecyficzna ekspresja genu IGF – 2 (tylko u mężczyzn) i H – 19 (u kobiet)

  • ICR (imprinting control region) H – 19 łączy się z CTFC