Inżynieria genetyczna

Ćwiczenie nr V

Cel ćwiczenia

1. Ligacja wektora pGEX-2T zlinearyzowanego enzymem BamHI i defosforylowanego (pGEX-2T/BamHI) z fragmentem DNA kodującym domenę wiążącą DNA receptora ekdysteroidowego (EcRDBD/BamHI) przy użyciu ligazy T4.

2. Transformacja komórek kompetentnych

Przebieg:

1. Ligacja wektora pGEX-2T zlinearyzowanego enzymem BamHI i defosforylowanego (pGEX-2T/BamHI) z fragmentem DNA kodującym domenę wiążącą DNA receptora ekdysteroidowego (EcRDBD/BamHI) przy użyciu ligazy T4.

• Plazmidowe DNA (pGEX-2T/BamHI, około 35 ng) zlinearyzowane enzymem BamHI oraz insert (EcRDBD/BamHI, około 3 ng), zmieszano w sterylnej probówce Eppendorfa.

• Reakcję ligacji prowadzono w temperaturze około 20^OC przez 1 h 53 min, w 1x buforze do ligacji w końcowej objętości 30 µl przy użyciu ligazy T4 (1U)

• Przygotowano próbę kontrolną zawierającą analogiczne składniki jak mieszanina ligacyjna lecz bez insertu

Mieszanina ligacyjna	Kontrola
0,8 µl wektora pGEX-2T/BamHI (10 ng) 2,1 µl insert cDNA EcRDBD/BamHI 1,0 µl ligazy T4 (MBI Fermentas) 3,0 µl buforu T4 (10x) (MBI Fermentas) 23,1 µl H2O miliQ auto	0,8 µl wektora pGEX-2T/BamHI (10 ng) Brak insertu 1,0 µl ligazy T4 (MBI Fermentas) 3,0 µl buforu T4 (10x) (MBI Fermentas) 25,2 µl H2O miliQ auto
30µl	30µl

1. Transformacja komórek kompetentnych

• Do schłodzonej probówki Eppendorfa zawierającej mieszaninę po ligacji dodano 90 µl zawiesiny komórek kompetentnych (XL1-Blue) rozmrożonych na lodzie

• Całość delikatnie wymieszano i inkubowano na lodzie przez 20 min, a natępnie przez 5 min w temperaturze 37^OC

• Po tym czasie dodano 90 µl pożywki LB i inkubowano w temp 37 ^OC przez około 20 min

• Następnie 180 µl zawiesiny transformowanych komórek wysiano na szalce Petriego z podłożem LB-agar zawierającym karbenicylinę w stężeniu końcowym 100 µg/ml

• Analogiczne czynności wykonano wobec kontroli

• Przeprowadzono inkubację w temp 37^OC przez 12 h oraz policzono kolonie transformantów wyrosłe na płytce po ligacji i płytce kontrolnej

Płytka po ligacji: 612 kolonii Płytka kontrolna: 1 kolonia

Podłoże do hodowli bakterii:

Podłoże LB-agar z karbenicyliną (100 µg/ml)	10 g 5 g 10 g 15 g
Ekstrakt drożdżowy Hydrolizat kazeinowy NaCl Agar
1 l H2O miliQ, pH 7,5 (1N NaOH)

Wnioski:

Ligaza T4 używana do ligacji wektora pGEX-2T (zlinearyzowanego enzymem BamHI i defosforylowanego) z fragmentem DNA kodującym domenę wiążącą DNA receptora ekdysteroidowego jest kodowana przez gen 30 bakteriofaga T4 i jest zbudowana z 487 aminokwasów. Substratami dla ligazy są cząsteczki kwasów nukleinowych o tępych i lepkich końcach. Do działania ligazy wymagane są jony magnezu oraz ATP. Jony pełnią rolę kofaktora natomiast ATP jest źródłem energii do tworzenia wiązań fosfodiestrowych [1]. Aby ligaza utworzyła wiązanie fosfodiestrowe wymagane są ufosforylowane końce 5’ które w naszym przypadku występują w insercie EcRDBD/BamHI.

Transformacja DNA jest procesem wnikania obcego DNA do komórki bakteryjnej. Forma wnikającego DNA musi mieć postać kolistą. Dla ułatwienia wniknięcia wektora do komórki bakteryjnej poddaje się ją działaniu chlorku wapnia. Obecne w mieszaninie jony wapnia reagują z błoną bakteryjną oraz wektorem DNA neutralizując ich negatywnie naładowane ładunki. Dodatkowe obniżenie temperatury do 4^OC powoduje stabilizację błony lipidowej. Następnie gwałtownie podwyższa się temperaturę tworząc „szok cieplny” w celu pobrania przez komórkę bakteryjną wektora [2].

Zawiesinę transformowanych komórek wysiewa się na podłożu zawierającym substancje odżywcze potrzebne do wzrostu oraz w naszym przypadku karbenicylinę, dzięki której na płytce rosną tylko komórki XL1-Blue zawierające nasz wektor i posiadające gen oporności na karbenicylinę. W próbie kontrolnej na płytce była obecna jedna kolonia bakterii. Na płytce po ligacji wyrosło 612 kolonii bakterii. Stopień religacji wektora wyniósł 0,16%.

Literatura:

[1] J. Sambrook & D. Russell - Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) CSHL Press, 2001

[2] http://www.dnalc.org/resources/animations/transformation2.html