Środowisko hodowlane

1 Czynniki kształtujące środowisko hodowlane

• rodzaj powierzchni, na której rosną komórki

• pożywka

• skład fazy gazowej nad pożywką

• temp hodowli

2 Naczynia hodowlane

• dawniej powszechnie wykorzystywano naczynia szklane

• obecnie stosuje się głównie naczynia plastikowe

• naczynia płaskodenne

• szalka petriego

• płytka 96 dołkowa

• płytka 12 dołkowa

3 Komórki po wysianiu muszą przyczepić się do podłoża, aby mogły rosnąć i proliferować.

• pierwszym etapem tworzenia się hodowli jest adhezja komórek do podłoża

• następnym etapem jest rozpłaszczenie się komórek, które zaczyna się w momencie, kiedy wydzielają one specjalne białka i proteoglikany wchodzące w skład macierzy pozakomórkowej, jak np. fibronektyna, laminina czy kolagen

• w wiązaniu komórek z podłożem biorą udział białka pochodzące z surowicy dodawanej do medium hodowlanego (wiążą się zarówno z kom jak i podłożem)

5 Warunki hodowli !!!!!!!!!!!! na kolosie

• odpowiednia pożywka

• czynniki wzrostowe

• ochrona przed mikroorganizmami

• temp 36,6 - 37˚C

• stała wilgotność

• pH zbliżone do naturalnego

• środowisko 5% CO2

6 Pożywki hodowlane

• naturalne (pierwsze pożywki) np.

1. limfa

2. surowica

3. osocze krwi

• sztuczne

1. RPMI

2. Dulbecco

3. Eagle’a

4. Hanksa

Rola: dostarczenie kom składników odżywczych niezbędnych do przeżywania, wzrostu i różnicowania

7 Pożywki sztuczne

• substancje odżywcze – glukoza, aminokwasy, lipidy, zasady purynowe i pirymidynowe

• witaminy (niezbędne do prawidłowego metabolizmu)

Najczęściej używane roztwory (balanced salt solution): Earl’s BSS, Dulbecco’s BSS

Skład soli buforowanej: sole nieorganiczne, glukoza….

8 pH pożywki hodowlanej

• zastosowanie buforów w pożywkach

1. bufor węglanowy

2. PBS (bufor fosforanowy)

3. bufor cytrynianowy

4. HEPES – kwas 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo] etanosulfonowy

Czerwień fenolowa – wskaźnik pH, wskaźnik zużycia pożywki

9 Surowica

• bydlęca – BS

• bydlęca płodowa – FBS

• cielęca

• końska

Surowicę można zastąpić odpowiednio dobranymi składnikami w formie chemicznie czystej: hormony, czynnik wzrostu fibroblastów, czynnik wzrostu naskórka, insulinopodobne czynniki wzrostu, fibronektyna, transferryna.

10% surowica

1% antybiotyk

Zawiera:

• albuminy – wiążą jony metali ciężkich, ochrona przy wirowaniu

• białka i czynniki wpływające na wzrost i podział komórek

przechowywanie: -20˚C

10 Wady związane z używaniem surowicy

• może być źródłem zakażenia wirusami lub mykoplazmą, może też zawierać toksyczne składniki

• poszczególne serie surowic nigdy nie są identyczne – jakość waha się w zależności od źródła surowicy, zwierząt dawców, ich zdrowia, pożywienia, sezonu

• może zawierać przeciwciała przeciw wirusom zwierząt zakażonych lub pochodzące ze szczepionek zwierząt szczepionych

Wady związane z używaniem pożywki bez surowicy

• wzrost kom jest wolniejszy

• wymaga szczególnej czystości odczynników, wody, materiałów i aparatów – usunięcie surowicy powoduje pozbawienie pożywki jej odtruwającego działania

11 Inkubator CO₂

Zabezpieczenie kontroli

• temperatury

1. dla komórek ssaków: 37˚C

2. dla komórek ptaków: 39˚C

3. dla komórek skóry ssaków i jąder: 34 – 36˚C

• stężenia CO2 – optymalne 5%, bez surowicy 10%

• wilgotności – utrzymywana przez napełnienie wodą tacek na dnie inkubatora

12 Ochrona przed mikroorganizmami

• jałowość procedury hodowlanej (jednorazowy sprzęt, komory laminarne, filtry – sączenie)

• dodatek antybiotyków do pożywki (penicylina, streptomycyna, gentamecyna)

13 Komory laminarne

• wydajność filtrów HEPA: 99,999% dla cząsteczek o wielkości 0,3 µm