Replikacja:
Prokariota posiadają poli-cis-tronowy mRNA – z jednego transkryptu powstają białka związane zwykle wspólnym szlakiem metabolicznym
Naturalnie występującą formą jest B-DNA – prawoskrętna, rowek większy szeroki o pośredniej głębokości, a rowek mniejszy wąski o pośredniej głębokości
Lewoskrętną nicią DNA jest Z-DNA
Telomery – specyficzna struktura nukleinowa, zawierająca powtórzenia krótkich fragmentów bogatych w adeninę i tyminę
Ludzkie telomery to TTAGGG
Telomeraza umożliwia wydłużanie nici 3’ w telomerach, zapewniając komórce nieśmiertelność biologiczną
Histon CenH3 jest dziedziczony epigenetycznie
Wiodący (guide) RNA odpowiada za dojrzewanie RNA i DNA
Budowa i funkcje podjednostek polimerazy III u E. coli:
dnaE – podjednostka alfa – elongacja łańcucha
dnaQ – podjednostka epsilon – możliwość korekty
holE – podjednostka theta – część struktury rdzenia
dnaN – podjednostka beta – zacisk/klamra
dnaX – podjednostka tau – dimeryzacja rdzenia
dnaX – podjednostka gamma – ładowacz zacisku
holA –podjednostka delta - ładowacz zacisku
holB – podjednostak delta prim - ładowacz zacisku
holC - ładowacz zacisku
holD - ładowacz zacisku
lig – ligaza – enzym łączący obie nici wiązaniem fosfodiestrowym
gyrA – podjednostka alfa gyrazy – tworzenie ujemnych skrętów na nici DNA
gyrB - podjednostka beta gyrazy - hydroliza ATP
Fragmenty Okazaki Prokaryota są pozbawione RNA primerów i komplementarne dodawanie nukleotydów zachodzi przy pomocy rybonukleazy H, polimerazy I oraz ligazy DNA
Beta-zacisk umożliwia zatrzymanie przetranskrybowanego fragmentu Okazaki i przyłączenie do niego primeru (działanie prymazy)
U E. coli naprzeciwko miejsca origin leżą miejsca terminatorowe Ter
U drożdży występują autonomicznie replikujące się sekwencje ARS, które wiążą kompleks rozpoznający origin i umożliwiają inicjację replikacji
U Eukariota bąble replikacyjne powstałe po stworzeniu primeru RNA (prymaza) i inicjatorowy iDNA (polimeraza alfa) aktywują czynnik RFC, co powoduje inicjację replikacji
Wyróżniamy trzy eukariotyczne polimerazy DNA: alfa (wiąże się z prymazą), delta (wymaga zacisku PCNA; 3’ -> 5’ egzonukleaza) i epsilon (3’ -> 5’ egzonukleaza)
Transkrypcja:
Transkrypcja zachodzi w kierunku 3’ -> 5’ n nici matrycowej (antysensownej, niekodującej)
Sekwencje łańcucha promotorowego: TTGACA (w pozycji -35) i TATAAT (w pozycji -10) są odczytywane przez czynnik sigma
Polimeraza RNA E. coli zbudowana jest z sześciu podjednostek: dwóch alfa, beta, beta prim, omega oraz (słabo związanej) sigma
U Eukariota wyróżniamy trzy polimerazy RNA:
RNAP I – zlokalizowana w jąderku, odpowiada za syntezę prekursorów rRNA
RNAP II – w nukleozolu, odpowiada za syntezę mRNA
RNAP III – w nukleozolu, syntetyzuje 5S rRNA, tRNA, snRNA, cytozolowe RNA
Inicjacja transkrypcji RNAP I polega na przyłączeniu białka UBF1 do promotora w miejscach bogatych w GC. Do UBF1 przyłącza się czynnik SL1, a następnie RNAP I
Inicjacja transkrypcji RNAP II polega na przyłączeniu kompleksu czynników transkrypcyjnych w kolejności: TF II D (do TATA box), TF II A (stabilizuje wiązanie TBP do DNA), TF II B (określa miejsce startu), TF II F (odpowiada za interakcje z niekodującym DNA) i na koniec samej polimerazy RNAP II
TF II D zbudowane jest z TBP (wiążącego się do TATA box) oraz TAFs (rozpoznających promotor)
Aby ruszyła transkrypcja do kompleksu RNAP II muszą przyłączyć się jeszcze TF II E (umożliwia przyłączenie TF II H do RNAP II), TF II H (umożliwia fosforylację) oraz TF II J (wymiatacz), które następnie oddysocjowują wraz z innymi czynnikami (pozostaje wyłącznie TF II H)
Inicjacja transkrypcji RNAP III polega na przyłączeniu TF III C w miejscu rozpoznania (po prawej stronie od pozycji 0). Do nici DNA w miejscu startu transkrypcji przyłącza się TF III B. TF III C oddysocjowują, a do TF III B przyłączona zostaje RNAP III
Po zakończeniu transkrypcji powstałe mRNA zostaje oczapkowane 7-metyloguanizyną (m7GpppmNp) na końcu 5’ z pomocą fosfohydrolazy (odłącza fosforan gamma), guanylotransferazy (przyłącza GTP), guanylo-7-metylotransferazy (metyluje guaninę; donorem grup metylowych jest adenozyno metionina), 2-O-metylotransferaza (przenosi grupę metylową w pozycję 7)
Po zakończeniu transkrypcji do powstałego mRNA zostaje przyłączony ogon poli(A) z pomocą enzymatycznego kompleksu (endonukleazy, poliadenylazy).
Wycinanie intronów (splicing) przeprowadzane jest za pomocą snRNA
Apolipoproteina B występuje w różnych formach, ponieważ w tych organach występuje fizjologiczny proces stymulujący mutację i prowadzący do powstania kodonu STOP, czego skutkiem jest skrócenie białka i zmiana jego funkcji
Do badań biochemicznych białek wykorzystywane są metody: elektroforezy pulsacyjnej (PFGE), elektroforezy w gradiencie denaturującym (DGGE), cięcia enzymami restrykcyjnymi, reakcji łańcuchowej polimeryzacji (PCR), czy sejwencjonowania
Translacja (biosynteza białek):
tRNA ma budowę „ liścia koniczyny” i zbudowany jest z (od końca 5’): pętli D, ramienia antykodonowego, ramienia zmiennego oraz pętli T. Ramię antykodonu oprócz samej trójki antykodonu zawiera także dwie pirymidyny oraz dwie zmodyfikowane puryny.
Rybosom bakteryjny zbudowany jest z dużej podjednostki 50S (31 białek, 23S i 5S rRNA) i małej podjednostki 30S (21 białek, 16S rRNA).
Inicjacja translacji u bakterii: Do małej podjednostki 30S nieaktywnego rybosomu przyłącza się czynnik IF-3, który powoduje oddysocjowanie dużej jednostki. Następnie w miejsce kodonu przyłącza się IF-1, IF-2-GTP, mRNA oraz tRNA związane z formylometioniną (kodonem START). Następuje oddysocjowanie czynników IF-1 i IF-3. Hydroliza GTP umożliwia przyłączenie dużej podjednostki 50S i dysocjację IF-2-GDP + Pi. Powstaje aktywny rybosom zdolny do przeprowadzenia translacji.
Elongacja translacji u bakterii opiera się na trzech fazach: dekodowaniu, transpeptydacji oraz translokacji. Dekodowanie polega na przyłączenie aa-tRNA do miejsca A rybosomu w procesie zasilanym energią z rozpadu GTP. Transpeptydacja oznacza przeniesienie polipeptydu z tRNA, w miejscu P na tRNA w miejscu A (wydłużenie łańcucha o jeden aminokwas). Translokacja to przejście peptydylo-tRNA w miejsce P z jednoczesnym wyrzuceniem tRNA pozbawionego części aminokwasowej przy pomocy GTP.
Terminacja translacji u bakterii: W fazie traslokacji w miejsce A może trafić kodon STOP, do którego przyłączy się czynnik RF-1 (rozpoznaje UAA lub UAG) lub RF-2 (rozpoznaje UAA lub UGA). Następnie w wyniku hydrolizy od tRNA odłącza się polipeptyd, a w miejsce A wchodzi RF-3 niosące GTP. Następuje hydroliza GTP i oddysocjowanie RF-1. Do rybosomu wchodzą czynniki RRF, EF-G z GTP, które powodują remodelację rybosomu, której skutkiem jest odłączenie tRNA, mRNA i pozostałych czynników. Zostaje sam nieaktywny rybosom, który może przeprowadzić kolejny cykl translacji.
Rybosom eukariotyczny zbudowany jest z dużej podjednostki 60S (49 białek, 28S, 5.8S, 5S rRNA) oraz małej podjednostki 40S (33 białka, 18S rRNA).
Inicjacja translacji w komórkach eukariotycznych: Do podjednostki 40S przyłączają się eIF1A oraz eIF3. Następnie inicjatorowi fMet-tRNA związany z eIF2 oraz eIF1 przyłącza się do kompleksu. Nić mRNA związana jest w strukturę przez eIF4A/B/E/G (białka wiążące czapeczkę) oraz PABP (które wiąże ogon poli(A)). W wyniku hydrolizy ATP następuje skanowanie mRNA w poszukiwaniu kodonu START (AUG). Następnie czynnik eIF-5 powoduje odłączenie wszystkich czynników i dzięki aktywności GTPazowej przyłączenie dużej podjednostki 60S.
Kompleks inicjacyjny powstaje z połączenia inicjatorowego tRNA, rybosomu 80S, eIF2, eIF3, eIF4.
miRNAs mogą powodować represję translacji, wymuszając deadenylację i degradację mRNA.
Sekwencja Shine-Dalgarno to sekwencja na mRNA, informująca 16S rRNA o bliskiej obecności kodonu AUG.
Elongacja translacji zachodzi w dwóch stanach: posttranslacyjnym (3 fazy) oraz pretranslacyjnym (2 fazy). Rybosom posiada trzy miejsca: A (aminoacylowe), P (peptydowe) oraz E (wyjścia). Potranslacyjna faza rozpoczyna się, gdy w miejscu E jest wolny tRNA, a w miejscu P, peptydylo-tRNA. W kolejnej fazie do miejsca A przyłącza się aa-tRNA, dzięki działaniu EF-Tu-GTP, a wolny tRNA ulega dysocjacji. Następnie dysocjacji ulega czynnik EF-Tu-GDP + Pi i następuje transpeptydacja. Pretranslacyjna faza rozpoczyna się, gdy w miejscu P jest wolny tRNA, a w miejscu A, peptydylo-tRNA (wydłużony o jeden aa). Następuje przejście do kolejnych miejsc i po zadziałaniu EF-G (translokazy G) i hydrolizie GTP, powrót do pierwotnego stanu posttranslacyjnego.
Pojawienie się błędu w miejscu A powoduje przyłączenie czynnika RF2 (uwalniającego) i przedwczesne zakończenie translacji, co wiąże się z uwolnieniem nieaktywnego polipeptydu.
Modyfikacje potranslacyjne:
Standardowa sekwencja sygnałowa zbudowana jest z domeny pozytywnej, hydrofobowej domeny, zawierającej zakręt glicynowy, domeny z miejscem rozpoznania cięcia oraz reszty białka, które ma zostać przeniesione do odpowiedniego kompartmentu komórkowego.
Sekwencje sygnałowe (SRP) zbudowane są z zwykle z 13-36 reszt aminokwasowych.
SRP specyficznie kierują białka do odpowiednich organelli komórkowych.
Kotranslacyjny eksport białek: Polipeptyd powstający na rybosomie może być związany do sekwencji sygnałowej tuż po powstaniu (jeszcze w czasie translacji mRNA) i kierowany do odpowiedniego organellum lub zewnątrzkomórkowo. Sygnał translokacyjny umożliwia przejście kanałami błonowymi, a peptydaza czołowa (sygnałowa) tnie łańcuch w miejscu cięcia, odcinając białko sekrecyjne. Końcowe fałdowanie białka odbywa się poza cytozolem.
Kanał prowadzący białko (PCC) występuje w komórkach jako dimer. Przez jedno PCC przechodzi mRNA, a przez drugi, translatujący, wychodzi białko powstałe w wyniku translacji tego mRNA. W ten sposób przenoszone jest wiele białek do wnętrza lumenu ER.
Transport do nukleoplazmy (jądra kom.) wymaga działania dodatkowych przenośników: importyn oraz czynników Ran-GTP i CAS. Białko z sekwencją SRP dojądrową (NLS) przyłącza się do dimeru importyn alfa/beta i przechodzi przez pory jądrowe. Tam Ran-GTP przejmuje podjednostke beta importyny, a Ran-GTP + CAS podjednostkę alfa. Podjednostki te wędrują wraz z czynnikami przez pory jądrowe do cytoplazmy, a następnie w wyniku hydrolizy GTP uwalniają podjednostki importyny. Transportowane są do nukleoplazmy poprzez NTF-2, a białko Ran odzyskuje GTP dzięki czynnikowi wymiany nukleotydu (Ran-GEF).
Do podstawowych modyfikacji posttranslacyjnych zaliczamy:
Acetylację – podstawienie grupą acetylową
Amidację na C-końcu – zastąpienie grupy hydroksylowej grupą organiczną lub wodorem
Cytrunilacja – deaminacyjna zmiana argininy w cytrulinę
Deamidacja – zmiana glutaminy w kwas glutaminowy, lub asparaginy w kwas asparaginowy
Defosforylacja – odłączanie grupy fosforanowej od seryny, tyrozyny, treoniny lub histydyny [fosfatazy]
Fosforylacja – podstawianie grupą fosforanową do seryny, tyrozyny, treoniny lub histydyny [kinazy]
Glikozylacja – reakcja przyłączenia grup glikozylowych do asparaginy, hydroksylizyny, seryny lub treoniny
Glutamylacja – przyłączenie kwasu glutaminowego (tubulina)
Hydroksylacja – podstawienie grupą hydroksylową
Karboksylacja – przyłączenie cząsteczki dwutlenku węgla
Lipoilacja – przyłączenie cząsteczki kwasu liponowego
Metylację – podstawienie grupą metylową
Nitrozylacja – przyłączanie tlenku azotu do grupy sulfhydrylowej cysteiny
Nukleozylacja – przyłączanie nukleotydów
Oksydacja – utlenianie
Sulfatacja – reakcja przyłączenia grup siarczanowych do tyrozyny
SUMOilacja – przyłączanie cząsteczki białka SUMO
Ubikwitynacja – przyłączenie cząsteczki ubikwityny
Łańcuch glikozylacyjny (oligosacharydowy) jest zbudowany z 14 składników: 3 glukoz, 2 N-acetyloglukozamin, 9 mannoz.
Nośnikiem służącym do N-glikozylacji jest fosforan dolicholu.
Kompleksy samoorganizujące się:
Do kompleksów samoorganizujących się zaliczamy mega-kompleksy białkowe, niektóre wirusy oraz niektóre białka strukturalne i włókienkowe.
Jednym z przykładowych kompleksów samoorganizujących się jest proteasom 26S. Zbudowany jest on z kompleksu rdzeniowego: siedmiu podjednostek alfa i siedmiu podjednostek beta (20S) oraz części regulatorowej: struktur części ATP-azowej i czapeczki (19S).
Dojrzewanie proteasomów wspomagają chaperony POC.
Hydrolaza bleomycyny Gal6p zbudowana jest z dwóch heksamerycznych pierścieni zbudowanych z trzech podjednostek każdy (łącznie sześć). W każdej podjednostce znajduje się centrum katalityczne osłonięte łańcuchem C, który umożliwia jej powrót do aktywności i chroni przed działaniem czynników zewnętrznych.
Oflankowanie substratu podjednostkami ATP-azowymi możliwe jest dzięki przyłączeniu do nich podjednostek ClpA lub ClpX. W przypadku zadziałania wyłącznie białka ClpA/ClpX substrat zostaje rozłożony pod wpływem uwolnienia energii zgromadzonej w ATP (powstają aktywne monomery). Jeśli oprócz białka ClpA/ClpX, do cząsteczki substratu przyłączy się także podjednostka ClpP, białko zostaje zdegradowane (traci swoje właściwości).
Wyróżnia się dwie podstawowe budowy kapsydów wirusowych: helikalną (np. u wirusa mozaiki tytoniowej) oraz ikozaedralną, inaczej kubiczną (np. u adenowirusów).
W wirusach helikalnych RNA zawsze jest związane z płaszczem białkowym. Połączenie tych struktur zależy od pH oraz siły jonowej. Agregacja następuję w pH 7, przy sile jonowej 0,2-0,5, gdy w organizację protohelixu wchodzi RNA i po określonej długości tworzy helikalną strukturę rybonukleoproteidu.
Złożona struktura bakteriofagów powstaje w dwóch procesach syntezy (głowy i ogona), a następnie składana. Prekursorami głowy bakteriofaga są gpB oraz gpNu3. Zostają one poddane fałdowaniu na chaperoninach GroEL/GroES, do niedojrzałego „łącznika”. Prekursor poddawany jest działaniu gpE i gpNu3. Wytworzenie dojrzałej głowy bakteriofaga wymaga przemian czynników gpE, gpC i gpB oraz oddysocjowania czynnika pNu3*. Następnie do głowy wprowadzany jest kwas nukleinowy przez gpD, a samo przejście zostaje zaczapkowane z pomocą gp@ i gpFII. Inicjator ogona bakteriofaga powstaje z gpJ po zajściu licznych procesów regulacyjnych (gpI, gpK, gpL, gpG, gpH, gpM). Inicjator poddawany jest wydłużaniu za pomocą gpV. Powstały U-ogon tworzy stabilną formę po oczapkowaniu gpU i gpZ. W takiej formie może połączyć się z dojrzałą głową i zbudować kompletny bakteriofag.
Dynamiczne zachowanie filamentów aktynowych (synteza, degradacja) spowodowane jest w celu zachowania homeostazy białek cytoszkieletu. Umożliwia to kompleks białek zbudowany z białek czapeczkujących, łączących włókna, łączących ATP, polimeryzacyjnych oraz depolimeryzacyjnych. Możemy podzielić te białka na 6 grup:
białka stabilizujące monomery aktyny (np. profilina),
białka inicjujące polimeryzacje monomerów oraz blokujące jedno z dwu zakończeń mikrofilamentów (np. gelsolina, wilina, fragmina),
białka stabilizujące mikrofilamenty (np. tropomiozyna mięśniowa, troponina),
białka formujące siateczkę mikrofilamentów (np. miozyna, filamina, spektryna),
białka formujące wiązki mikrofilamentów (np. alfa-aktynina),
białka przymocowujące włókna aktyny do podstruktur komórki (np. winkulina).
U roślin białkiem kluczowym do stworzenia filamentu jest formina, która występuje jako dimer, stabilizując strukturę krzyżową monomerów G-aktyny i umożliwiając ich dimeryzację.
Fałdowanie białek:
Proces fałdowania białek związany jest z obecnością dwóch grup białek:
Chaperony – oddziałują z białkami w formie nienatywnej (ale też niezdenaturowanymi), często wymagają aktywności ATP-azowej (np. Hsp70, Hsp40)
Chaperoniny – od chaperonów różnią się tym, że posiadają kanał, w którym białko może uzyskać natywną konformację (oddzielone od środowiska zewnętrznego, np. GroEL/GroES, TRiC)
Prawidłowo zwinięte białka mają hydrofobowe reszty aminokwasowe umieszczone we wnętrzu swoich struktur. Białka opiekuńcze rozpoznają wyeksponowane reszty hydrofobowe i oddziałują z nimi.
U Prokariota system fałdujący zbudowany jest z kompleksu HslV/HslU, białek Clp (A/X/P), Hsp70, Hsp60, chaperonin GroEL/GroES typu I oraz kompleksów rekombinacyjnych.
Chaperoniny GroEL/GroES typu I zbudowane są z podwójnego pierścienia białkowego, posiadających trzy domeny funkcyjne: pierścień cis (wiąże ATP), pierścień trans oraz czapeczkę. Niesfałdowane białko wchodzi do otwartej struktury GroEL przez kanał znajdujący się na szczycie chaperoniny, zostaje zamknięte przez czapeczkę GroES, a domeny cis wiążą ATP. Następnie zachodzi proces fałdowania, który trwa ok. 10-20 sekund i wymaga ok. 7 cząsteczek ATP. W ostatnim etapie czapeczka ulega dysocjacji spowodowanej wymianą ADP na ATP w pierścieniu cis, a sfałdowane białko zostaje uwolnione do cytoplazmy.
Chaperoniny GroEL/GroES wykazują allosteryczność. Można zaobserwować je w dwóch stanach: skupionym (T - ang. tense) lub rozluźnionym (R - ang. relaxed). W stanie T podjednostka GroEL ma większe powinowactwo do polipeptydów, a w stanie R – do ATP.
Błędy w fałdowaniu białek mogą prowadzić do powstania różnych chorób np. choroby Alzheimera (defekt beta-amyloidu), Huntingtona (defekt huntingtyny), Parkinsona (defekt alfa-synukleiny).
Struktura termosomu (TRiC, CCT) nie posiada czapeczki GroES w swojej części apikalnej. Reaguje on w specyficznym spektrum białkowym, pomagając w fałdowaniu głównie białek cytoszkieletu. Białka należące do tej rodziny odkryto m.in. w grupie Archeabacteria (Methanococcus jannashii, Sulfolobus), jak i u Eukariota. Pokazuje to niezwykłą różnorodność i względną stałość filogenetyczną termosomu.
U Eukariota system fałdujący zbudowany jest z kompleksu proteasomu 26S, kompleksu Sec61, znajdującego się na ER, chaperonin GroEL/GroES typu II, czynników wspomagających, regulatorowych i kierujących fałdowanie oraz mitochondrialnych struktur fałdujących (proteasomów Yta, Hsp10, Hsp60, chaperoniny GroEL/GroES typu I).
Trigger factor (TF) jest białkiem-poszukiwaczem. Po translacji białek TF wyszukuje niesfałdowane białko i przekazuje je do systemu Hsp60 lub Hsp70, które umożliwiają mu przejście do struktury natywnej.
Lej zwijania (ang. folding funnel) – entropiczny model fałdowania białek biorący pod uwagę lokalne minima i maksima energii kinetycznej zależne od wielkości zwinięcia białka, znajdujące się w asocjacji z podjednostkami katalitycznymi.
Ewolucja molekularna:
Eksperyment Stanleya Millera (Chicago, 1953) próbował przedstawić początek życia na Ziemi. Był to pierwszy eksperyment, który wykazał możliwość powstawania prostych, podstawowych związków organicznych ze związków nieorganicznych. Doświadczenie Millera zakłada, że pierwotna atmosfera Ziemi była silnie redukująca. W atmosferze obojętnej - postulowanej obecnie przez niektórych geochemików - wydajność reakcji syntezy związków organicznych, a przede wszystkim aminokwasów zmniejsza się o kilka rzędów wielkości.
Głównymi biologami ewolucyjnymi byli Aleksandr Oparin (spontaniczne pojawienie koacerwatów i ewolucja do stanu komórkowego) oraz John Haldane (synteza coraz bardziej złożonych związków organicznych w świetle UV).
Na filogenetycznym drzewie życia wyróżniamy kilka podstawowych gałęzi (królestw): Eubacteria (jednokomórkowe, prokariotyczne), Archaebacteria (jednokomórkowe, prokariotyczne), Protista (jedno- lub wielokomórkowe, eukariotyczne), Plantae, Animalia, Fungi (wielokomórkowe, eukariotyczne).
Wraz ze zwiększaniem odległości filogenetycznej zwiększają się także zmiany w sekwencji DNA organizmów oraz obecność/stężenie poszczególnych substancji.
Reakcje enzymatyczne w pierwotnym świecie były katalizowane przez poszczególne związki niskocząsteczkowe. [reakcja – wymagania -> substraty]
Dekarboksylacja – podstawowe proteinoidy oraz ich pochodne kwasowe -> szczawiooctan, pirogronian
Esteraza – histydyna -> fosforan p-nitrofenylu
ATPaza – Zn2+ -> ATP
Aminacja/deaminacja – Cu2+ -> alfa-ketoglutaran <-> glutaminian
Peroksydaza/katalaza – hem, podstawowe proteinoidy -> H2O2, donory wodoru (hydrochinon, NADH)
Można przypuszczać, że początki naszego świata znajdują się w „Świecie RNA”. Kontrola nad ewolucją spoczywała w ramionach rybozymów. Matryca rybozymowa (ssRNA) mogła zostać wykorzystana w procesie przekazywania sygnału (przepisania na białko), lub replikacji (powstania komplementarnej nici dsRNA)
Wynalezienie prymitywnej fotosyntezy zapoczątkowało wykorzystywanie tlenu, jako czynnika środowiskowego – oddychanie tlenowe.
Duplikacja w genach mogła prowadzić do stworzenia nowych genów, np. na skutek duplikacji w ancestralnym genie globinowym i późniejszemu różnicowaniu (poprzez mutacje) mogły powstać hemoglobina i mioglobina.
Homologi to geny, których sekwencja jest podobna na tyle, że można założyć ich wspólne pochodzenie (filo)genetyczne.
Ortologi to geny homologiczne, które można znaleźć w dwóch oddzielnych gatunkach, gdy ich linie filogenetyczne się rozdzieliły (dywergencja).
Paralogi to geny homologiczne, które znajdują się w tym samym organizmie, powstałe w wyniku duplikacji.
Poprzez rekombinację genetyczną mogą powstawać nowe geny o połączonych, synergicznych funkcjach (np. receptor LDL).
Niekodujące DNA ewoluuje szybciej niż DNA kodujące. Jest to związane z tym, że mutacje wewnątrz intronów nie mają efektu w postaci transkryptu mRNA i nie są reprezentowane w białku.
Inżynieria białek:
W zależności od rodzaju białka (mutant, typ dziki) potrzeba różnej energii do osiągnięcia sfałdowanej struktury, gdyż taka natywna struktura charakteryzować się będzie różnymi konformacjami.
Wykres Chevrona jest sposobem prezentacji danych kinetycznych fałdowania białka w obecności różnych stężeń czynnika denaturującego, który zakłóca natywną strukturę trzeciorzędową białka. Wykresem funkcji jest logarytm stwierdzonej szybkości relaksacji względem stężenia czynnika.
Lej zwijania (ang. folding funnel) – entropiczny model fałdowania białek biorący pod uwagę lokalne minima i maksima energii kinetycznej zależne od wielkości zwinięcia białka, znajdujące się w asocjacji z podjednostkami katalitycznymi. Wraz ze spadkiem energii zewnętrznej białka wzrasta jego upakowanie. Białka dążą do jak najmniejszej energii zewnętrznej, a więc ich forma natywna będzie się charakteryzowała ciasnym zwinięciem. Przed osiągnięciem formy natywnej białka mogą zatrzymać się w niesfałdowanym stanie (tzw. Molten globule), gdy nie są w stanie dostarczyć energii do osiągnięcia lokalnego maksimium stanu przejściowego. Ich struktura drugorzędowa formuje łańcuch ściśle upakowany, co blokuje fałdowanie do aktywnej formy natywnej.
Istnieją różne modele leków zwijania: idealny lej umożliwia poprawne fałdowanie z każdej pozycji początkowej (ciągły spadek do formy natywnej), „dołek golfowy” Levinthala ogranicza specyficznie punkt natywnego zwinięcia, klasyczny krajobraz fałdowania przedstawia pojedynczą dolinę ukierunkowaną (fragmentarycznie) w stronę formy natywnej, a „górzysty” lej, mimo początkowych szerokich możliwości zwijania do form przejściowych, ogranicza fałdowanie przez lokalne działanie minimów i maksimów (ugrzęźnięcie w jednym z minimów skutecznie „chroni” białko przez poprawnym zwinięciem w natywną formę).
Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) wykorzystuje własności magnetyczne jąder, które mają określony stan w polu magnetycznym i w czasie stosowania impulsów elektromagnetycznych (EM). Jądra absorbują energię impulsu EM i emitują tę energię z powrotem. Na podstawie tej energii promieniowania określona zostaje częstotliwość rezonansowa, która zależy od siły pola magnetycznego, oraz innych czynników.
Dichroizm kołowy to zjawisko polegające na różnej absorpcji przez substancje światła spolaryzowanego kołowo prawoskrętnie i lewoskrętnie. To zjawisko pozwala określi lokalizację optycznie aktywnych cząsteczek chiralnych. Spektroskopia może się odbywać różnymi długościami fali: dalekim UV, bliskim UV (>250 nm), VIS. Substancje nieczynne optycznie (achiralne) mogą wykazywać zjawisko dichroizmu kołowego pod wpływem zewnętrznego pola magnetycznego - zjawisko to znane jest jako magnetyczny dichroizm kołowy (ang. magnetic circular dichroism, MCD).
Metody rozpraszania rentgenowskiego należy do nieniszczących technik analitycznych, dzięki którym możemy dowiedzieć się informacji na temat struktury krystalograficzne, składu chemicznego i właściwości fizycznych badanych materiałów. Metoda ta opiera się na obserwacji rozproszonej intensywności wiązki rentgenowskiej, rozproszonego kąta polaryzacji, a także długości fali lub energii.
W fizyce i chemii obliczeniowej pole siłowe to termin oznaczający zarówno funkcję jak i zestaw parametrów mających na celu opisanie energii potencjalnej układu cząsteczek. Zwykle termin ten pojawia się w kontekście dynamiki molekularnej oraz mechaniki molekularnej, gdzie odgrywa niezbędną rolę jako przybliżenia rzeczywistej funkcji potencjału. Do czasów obecnych opracowano bardzo wiele różnych pól siłowych.
Modelowanie i przewidywanie struktury białek może być przeprowadzone za pomocą: CASP (oszacowanie), modelingu homologów, rozpoznania fałdowania (sposobu ułożenia), przewidywania struktur z wzorców (badania dynamiki molekularnej, energii konformacyjnej, programy Rosetta/Linus).
Synteza peptydów na nośniku stałym (żywicy) metodą Fmoc/tBu składa się z kilku etapów. Pierwszy etap syntezy stanowi proces przyłączenia C-końcowego aminokwasu do „linkera” żywicy. Kolejny etap stanowi proces wydłużanie łańcucha polipeptydowego polegający na cyklicznym przyłączaniu kolejnych reszt aminokwasowych. Ostatni etap syntezy polega na odszczepiania peptydu od żywicy z jednoczesnym usunięciem grup ochronnych z łańcuchów bocznych aminokwasów.
Regulacja transkrypcji u Prokariota:
Regulacja transkrypcji może odbywać się na różnych poziomach tego procesu, od dostępu do kodującego DNA, przez jego rozpoznanie, na procesie transkrypcji kończąc.
Można powiedzieć, że mechanizm regulatorowy może być „wydajny”, gdy dzieje się na poziomie transkrypcji (ang. efficient) , albo „nagły”, gdy następuje na poziomie potranslacyjnym (ang. rapid).
Czynnikiem regulatorowym jest odpowiedź na temperaturę. W normalnej temperaturze czynnik RpoH sigma przyłącza się do chaperonin (Hsp) i prezentuje je kompleksowi proteazy ClpP, która degraduje chaperoniny. W wysokiej lub ekstremalnej temperaturze aktywowane chaperoniny są związane ze źle sfałdowanymi białkami, wolny czynnik RpoH sigma aktywuje geny szoku cieplnego, co przyspiesza ich ekspresję.
Kaskada czterech czynników sigma umożliwia stopniowe różnicowanie sporów bakterii z rodzaju Bacillus. Zewnętrzny sygnał inicjacyjny aktywuje syntezę czynnika sigma F w sporze. Ten jest niezbędny w procesie transkrypcji dla genu sigma G (wewnątrz spory) i przekształcenia pre-sigma E w aktywny czynnik sigma E (na zewnątrz spory). Czynnik sigma E jest niezbędny do syntezy prekursora pre-sigma K. W końcu czynnik sigma G migruje z wnętrza spor na zewnątrz i aktywuje czynnik sigma K.
Czynniki anty-sigma SpoIIAB wiążą się do sigma F i inaktywują go. Kiedy komórka otrzyma zewnętrzny sygnał inicjacyjny ufosforylowany zostaje czynnik anty-anty-sigma SpoIIAA, który przyłącza się do anty-sigma SpoIIAB, co powoduje uwolnienie czynnika sigma F i rozpoczęcie kaskady sporulacyjnej.
W pozytywnej regulacji, zmiana sygnału powoduje przyłączenie aktywatora do regionu regulatorowego genu po związaniu cząsteczki sygnalnej. Następnie następuje przyłączenie polimerazy RNA, która przeprowadza transkrypcję genu.
W negatywnej regulacji, zmiana sygnału powoduje odłączenie represora od regionu promotorowego genu po związaniu cząsteczki sygnałowej. Następnie następuje przyłączenie polimerazy RNA, która przeprowadza transkrypcję genu.
Niektóre bakteryjne geny strukturalne są ulokowane w poli-cis-tronowym DNA. W procesie transkrypcji powstaje jedna, długa nić poli-cis-tronowego mRNA, jednak w procesie translacji powstaje z niego kilka białek funkcjonalnych.
Operon laktozowy (lac) zbudowany jest z trzech genów strukturalnych (lacZYA), które transkrybowane są w formie pojedynczego genu (kontrolowane przez jeden promotor lacP). Tromotor regulowany jest poprzez związanie represora do operatora (lacO) i białka Crp do miejsca wiążącego Crp. Z tego jednego genu strukturalnego powstają trzy białka funkcjonalne. Gen lacI kodujący represor LacI posiada własny promotor i jego transkrypcja zachodzi w kierunku przeciwnym do operonu lac. Gdy represor LacI zwiąże się do miejsca operatora, transkrypcja nie zachodzi. Przyłączenie induktora (allo-laktoza, IPTG) usuwa jednak represor i umożliwia transkrypcję operonu polimerazie RNA.
Miejsca wiązania determinują represję lub aktywację procesu transkrypcji. Związanie białka wiążącego DNA w miejscu promotora regionu operatora działa jako represja i uniemożliwia przyłączenie się polimerazy RNA. To samo białko może jednak przyłączyć się do miejsca aktywacji, co powoduje związanie polimerazy RNA i zajście transkrypcji. Rozpoznanie sekwencji przez białko wiążące DNA jest identyczne, zmienia się jedynie jego pozycja.
Dimery AraC mogą pełnić funkcję zarówno represora (gdy nie wiążą arabinozy), jak i aktywatora (gdy wiążą arabinozę). Gdy AraC wiąże arabinozę dimer zmienia konfigurację i wiąże się do DNA w miejscu 1 i 2. Powoduje to związanie do regionu pornotorowego polimerazy RNA. Gdy AraC nie wiąże arabinozy dimer (prezentujący inną konformację) wiąże się do miejsc 2 i 3 i formuje pętlę DNA, co prowadzi do inaktywacji genu.
W przypadku wysokiego poziomu argininy represor ArgR wraz z korepresorami wiąże się do podwójnego regionu operatorowego genów strukturalnych argininy, co uniemożliwia przyłączenie polimerazy RNA i syntezę tego aminokwasu. Gdy stężenie argininy spada, w miejsce represora może przyłączyć się polimeraza RNA.
Kanał błonowy PtsG jest otwarty dla glukozy, gdy jest ufosforylowany. Glukoza, wchodząc do komórki, musi zostać przekształcona do formy glukozo-6-fosforanu (G6P) – „zdejmuje” grupę fosforanową z kanału PtsG. Zdefosforylowany kanał wiąże represor Mlc, który uniemożliwia wejście do cytoplazmy kolejnych cząsteczek glukozy. W wyniku rozkładu G6P powstaje grupa fosforanowa, która może się przyłączyć do PtsG i w ten sposób ponownie go uaktywnić (Mlc zostanie oddysocjowany).
W zależności od stanu redox białko OxyR zmienia swoją konformację i powinowactwo do DNA. Postać utleniona posiada mostki disulfidowe i wiąże się z DNA. Postać zredukowana posiada grupy sulfhydrylowe, które nie mają powinowactwa do kwasów nukleinowych.
W zależności od stanu redox białko Fnr zmienia swoją konformację i powinowactwo do DNA. Postać utleniona jest nieaktywna, a postać zredukowana wiąże DNA.
Dwucząsteczkowy (dwupoziomowy) system regulacji zawiera składnik błonowy oraz składnik cytoplazmatyczny. Na zewnątrz komórki znajduje się sensor (domena receptorowa), który w wyniku wzbudzenia zmienia konformację wewnątrzkomórkowej domeny (nadajnika/przekaźnika) i wytwarza w niej aktywność ATPazy. Powstały po rozpadzie ATP do ADP fosforan przyłączony zostaje do domeny przekaźnikowej, by następnie oddyfundować do cytoplazmy, gdzie zostanie przechwycony przez regulator odpowiedzi w wyniku czego powstanie forma regulatora wiążąca się do DNA.
Istnieją także regulatory (przekaźniki) czteroskładnikowe – ArcAB należy do systemu regulatorowego zbudowanego z sensora błonowego (ArcB) i białka wiążącego DNA (ArcA). Grupa fosforanowa przechodzi „po” sensorze, przyłączając się kolejno do His, Asp i His, aż w końcu trafia na Asp regulatora ArcA.
Białka Crp mogą wiązać cykliczny adenozynomonofosforan (cAMP) i spontanicznie łączyć się w pary (dimery), które mają zdolność do wiązania się do DNA. Zaburzenie równowagi cAMP (podstawowych cząsteczek sygnałowych II rzędu) może powodować zmiany w fosforylacji kaskad białkowych, co skutkuje błędami w odpowiedzi komórkowej. Crp + cAMP jest uznawany także za aktywator dla genów operonu laktozowego. Jego aktywacja nie dominuje nad aktywnością specyficznego represora LacI.
Transkrypcja DNA rozpoczyna się w momencie związania polimerazy RNA do promotora. W przypadku braku czynnika anty-terminującego transkrypcję powstaje poprawnie utworzone mRNA (zakończone na teminatorze) i polimeraza RNA. W przypadku przyłączenia się czynnika anty-terminującego do polimerazy RNA, ta nie zatrzymuje się w miejscu terminatora, ale zachodzi produkcja mRNA poza rejonem terminatora (czyli intronowego, niekodującego).
Polimeraza RNA wymaga rozpoznania podjednostki sigma związanych w regionie promotora, a także przyłączenia podjednostki NusA w czasie transkrypcji genów strukturalnych. Po zakończeniu transkrypcji i terminacji NusA zostaje uwolnione, a polimeraza RNA wiąże się ponownie z czynnikiem sigma.
Regulacja transkrypcji u Eukariota:
Czynniki transkrypcyjne (TF) posiadają dwie niezależne domeny. Wiązanie i transkrypcja następuje wyłącznie wtedy, gdy odpowiednia domena wiążąca połączy się z DNA w specyficznym miejscu (przed promotorem), a druga z polimerazą RNA II.
Fałdowanie DNA w celu związania białek aktywujących transkrypcje dołączonych do sekwencji enahcerów (wzmacniaczy) oraz białek regulatorowych (przyłączonych do DNA) do aparatu transkrypcyjnego (przyłączonego do TATA box) wymaga obecności kompleksu mediatorów.
Sekwencje izolatorowe ograniczają zakres działania wzmacniaczy. Duża pętla DNA umożliwia interakcję pojedynczego enhancera z genami X oraz Y. Izolujące białko wiążące DNA (IBP) uniemożliwia działanie enhancera poza pętlą.
Na wielu pętlach występuje tylko jedna pętla DNA wolna od histonów, pochodząca z regionu rusztowania otoczki jądrowej. DNA może być w niej zakotwiczone za pomocą białek MAR.
Nim dojdzie do transkrypcji odpowiednie czynniki muszą utworzyć kompleks (aparat transkrypcyjny). Regulowane jest przez przyłączenie sekwencji CAAT do białek CTF (aktywacja transkrypcji) lub białek CDP (zatrzymanie ekspresji genów).
Bliskie upakowanie nukleosomów stabilizują wiązania ogonów histonowych i samych histonów z sąsiadujących nukleosomów. W przypadku acetylacji ogona histonu H4 wiązania rozluźniają się, a struktury oktamerów histonowych oddysocjowują od siebie. Acetylacja histonów przeprowadzana jest przez transferazy HAT i może być przeprowadzana dzięki działaniu koaktywatorów.
Ślizganie się (przesuwanie) po nukleotydzie wymaga zadziałania kompleksu remodelującego Swi/Snf. Przeprowadzane jest ono w celu uwolnienia spod wiązania histonów i wyeksponowania promotora na działanie polimerazy.
Wyciszanie sygnałów komórkowych przez metylację polega na… metylacji regionów DNA bogatych w pary GC. Do zmetylowanych regionów przyłącza się białko wiążące metylocysteinę (MeCP) oraz deacetylaza histonów (HDAC). Następuje deacetylacja histonów, czego konsekwencją jest agregacja nukleosomów w formę heterochromatyny (niedostępną do transkrypcji).
Dwie kopie tego samego genu w gametach, z których jedna jest zmetylowana, połączono. Po zapłodnieniu okazało się, że zmetylowany gen był nieaktywny, więc embrion posiadał jeden aktywny i jeden nieaktywny gen. Większość wzorów metylacji jest programowana we wczesnym rozwoju zarodkowym, a jeśli kilka przetrwa, rezultatem jest imprinting.
Regulacja transkrypcji na poziomie RNA:
Możemy wyróżnić sześć kategorii regulacyjnych:
Kontrola nad szybkością degradacji mRNA
Modyfikacja nietranslatowanego RNA do formy, która może ulegac translacji
Kontrola translacji mRNA przez białka regulatorowe
Wiązanie antysensownego RNA do mRNA, aby zapobiec jego translacji
Kontrola translacji mRNA przez riboswitches
Preferencyjna translacja niektórych klas mRNA z powodu zmiany rybosomu
Stabilizację glg mRNA reguluje poziom białka CsrA. Po związaniu białka mRNA zmienia konformację na niestabilną i powstały transkrypt jest dużo bardziej podatny na degradację.
Region kodujący adhE jest sekwencją, która uniemożliwia związanie transkryptu z rybosomem poprzez blokowanie miejsca wiążącego rybosom (RBS). Ten odcinek zostaje wycięty przez RNazę III, co umożliwia translację białka.
Duży wpływ na translację mRNA ma ferrytyna. Jeśli żelazo występuje w obfitości w regionie IRE (regulatorowy region żelazo-czuły) następuje synteza wolnej ferrytyny, co umożliwia związanie rybosomu do struktury czapeczki i inicjację translacji. W przypadku deficytu białko regulatorowe zawierające żelazo (IRP) zapobiega przyłączaniu się podjednostek rybosomu do transkryptu mRNA.
Aktywna akonitaza, zawierająca w swoim centrum klaster żelazowo-siarkowy, ma zamkniętą strukturę. W przypadku deficytu żelaza domeny akonitazy mogą się otworzyć i „wpuścić” do wnętrza fragment IRE, co pozwoli na przyłączenie się rybosomu do mRNA i translację. Konsekwencją związania IRP1 do mRNA jest zablokowanie syntezy transferryny.
Translacja może być regulowana przez antysensowny RNA. mRNA powstałe po transkrypcji wykorzystało niekodującą nić DNA jako wzorzec. Jeśli RNA powstanie na nici kodującej, stworzy sekwencję komplementarną do właściwego mRNA, tzw. antysensowne RNA. Ten rodzaj RNA reguluje syntezę bakterioferrytyny. Jeśli komplementarny fragment anty-bfr RNA przyłączy się do transkryptu genu bfr nie zajdzie translacja.
Fosforylacja małej podjednostki rybosomalnej 6S może aktywować działanie kinaz białkowych. Posiadanie grupy 5’-TOP znacząco ułatwia to translację.
Interferencja RNA jest procesem potranskrypcyjnym wywołanym przez wprowadzenie dwuniciowego RNA (dsRNA), który prowadzi do wyciszenia genu w sposób specyficzny dla sekwencji.
Pierwszy etap jest krokiem inicjującym i obejmuje on powstanie, a następnie fragmentację dsRNA, w wyniku czego powstają 21-26 nukleotydowe fragmenty RNA. Matrycą do produkcji dsRNA, może być wirusowy RNA, odwrócone powtórzenia, transgeny, bądź też wprowadzona do komórki syntetyczna cząsteczka dsRNA. Krótkie fragmenty siRNA powstają w wyniku cięcia dsRNA przez RNAzę III Dicer. Natomiast w drugim etapie siRNA wchodzi do kompleksu RISC i w oparciu o homologię sekwencyjną doprowadza do degradacji mRNA. Jeśli powstałoby zbyt mało cząsteczek siRNA i wyciszanie przebiegałoby nieefektywnie, jest możliwość namnożenia tych cząstek, dzięki aktywności RdRP. Cząsteczki siRNA doprowadzają nie tylko do degradacji odpowiedniego fragmentu mRNA, ale mogą również przyczyniać się do kowalencyjnych modyfikacji sekwencji DNA oraz histonów.
W dziedzinie biologii molekularnej, przy ryboprzełącznik (ryboswitch) jest to fragment cząsteczki regulacyjnej RNA, która wiąże małe cząsteczki, w wyniku zmian w produkcji białek kodowanych przez mRNA. Tak więc, mRNA, który zawiera ryboprzełącznik jest bezpośrednio zaangażowany w regulowanie własnej aktywności w odpowiedzi na stężenie jej cząsteczek efektorowych.
Atenuacja - sztuczne otrzymywanie odmian patogenów (wirusów, grzybów, bakterii) o znacznie obniżonej zdolności do wywoływania chorób (wirulencji) przy równoczesnym zachowaniu ich immunologicznego oddziaływania na organizm, w celu wyprodukowania szczepionki. Atenuowany ustrój chorobotwórczy jest nadal żywy, ale niezdolny do wywołania choroby.