sprawko białka

Paulina Krzemińska 30.11.2011r.

Sprawozdanie z ćwiczenia 4:
Frakcjonowanie i oznaczanie białek mleka.

  1. Etapy procesu:

    1. Wytrącanie kwasem octowym kazeiny, a następnie jej odsączenie (stanowi ok. ¾ białek mleka, więc musimy się jej pozbyć, aby później móc dokładnie oznaczyć zawartość albumin i globulin); w przesączu znajdowało się 25 ml serwatki.

    2. Wytrącenie osadu globulin roztworem (NH4)2SO4 i odwirowanie go w celu oddzielenia go od albumin.

    3. Dalsze nasycanie roztworu znad osadu, prowadzi do wytrącenia się osadu albumin, które również odwirowujemy.

  2. Oznaczanie białek metodą Bradforda:

Jest to spektrofotometryczna metoda opierająca się na krzywej kalibracyjnej, którą tworzymy na podstawie pomiarów roztworów o znanych stężeniach, przy uprzednim pomiarze tła (roztwór soli fizjologicznej z barwnikiem).

Tworzymy roztwory białek w soli fizjologicznej, które po dodaniu odczynnika barwiącego Bio-Rad Protein Assay zmieniają kolor. Zmiana barwy polega na oddziaływaniu głównie z argininą, w mniejszym stopniu z innymi zasadowymi aminokwasami. Absorbancję mierzymy dla długości fali równej 595 nm.

  1. Oznaczenie zawartości albumin i globulin:

Albuminy:

Przeprowadziliśmy dwie serie pomiarów krzywej kalibracyjnej, ale jedną odrzuciłam z powodu gorszej liniowości przebiegu.

Objętość dodanego wzorca [µl] Absorbancja Stężenie [µg/µl]
1 0,075 0,0020
2 0,091 0,0040
4 0,249 0,0079
6 0,369 0,0118
8 0,433 0,0157
10 0,550 0,0196

Stężenia albumin w poszczególnych próbkach obliczyłam według schematu:


$$c = \frac{1,98\left\lbrack \frac{\text{μg}}{\text{μl}} \right\rbrack*1\mu l}{1000\mu l + 1\mu l} = 0,0020\lbrack\frac{\text{μg}}{\text{μl}}\rbrack$$

Poniższy wykres przedstawia krzywą kalibracyjną wraz z jej równaniem:

Absorbancja mojej próbki wynosiła 0,107, więc jej stężenie to 0,00339 [µg/µl].

Globuliny:

W poniższej tabeli zestawiamy wyniki pomiarów spektrofotometrycznych lepiej dopasowanej krzywej dla globulin:

Absorbancja Stężenie [µg/µl]
-0,09 0,0011
0,038 0,0022
0,058 0,0044
0,096 0,0066
0,178 0,0088
0,181 0,0110

Stężenie liczyłam taką samą metodą jak dla albumin, z tym, że stężenie globulin wynosiło 1,11 [µg/µl]


$$c = \frac{1,11\left\lbrack \frac{\text{μg}}{\text{μl}} \right\rbrack*1\mu l}{1000\mu l + 1\mu l} = 0,0011\lbrack\frac{\text{μg}}{\text{μl}}\rbrack$$

Krzywa kalibracyjna dla globulin (odrzuciłam drugi i ostatni punkt):

Absorbancja mojej próbki wynosiła 0,191, więc z równania krzywej wynika, iż jej stężenie wynosi 0,00911[µg/µl].

Obie próbki były wielokrotnie rozcieńczone, więc ich prawdziwe stężenie w mleku jest inne, niż powyżej przedstawione. Aby obliczyć prawdziwe stężenie białek musimy uwzględnić:


$$c_{\text{alb}} = 0,00339*1,25 = 0,00424\lbrack\frac{\text{μg}}{\text{μl}}\rbrack$$


$$c_{\text{alb}} = 0,00415*40 = 0,170\lbrack\frac{\text{μg}}{\text{μl}}\rbrack$$


$$m_{\text{alb}} = 0,170\left\lbrack \frac{\mu g}{\mu l} \right\rbrack*5000\left\lbrack \mu l \right\rbrack = 848\lbrack\mu g\rbrack$$


$$m_{\text{alb}} = 848\lbrack\mu g\rbrack*\frac{25\left\lbrack \text{ml} \right\rbrack}{3\left\lbrack \text{ml} \right\rbrack} = 7,063\lbrack mg\rbrack$$


$$c_{\text{glob}} = 0,00911*1,25 = 0,0114\lbrack\frac{\text{μg}}{\text{μl}}\rbrack$$


$$c_{\text{glob}} = 0,0114\left\lbrack \frac{\mu g}{\mu l} \right\rbrack*20 = 0,228\lbrack\frac{\mu g}{\mu l}\rbrack$$


$$m_{\text{glob}} = 0,228\left\lbrack \frac{\text{μg}}{\text{μl}} \right\rbrack*5000\left\lbrack \text{μl} \right\rbrack = 1139\lbrack\mu g\rbrack$$


$$m_{\text{glob}} = 1139\left\lbrack \text{μg} \right\rbrack*\frac{25\lbrack ml\rbrack}{3\lbrack ml\rbrack} = 9,490\lbrack mg\rbrack$$

Aby obliczyć zawartość procentową w mleku, muszę znać masę 25 ml mleka. Gęstość mleka to 1,028[g/ml]:


$$m_{\text{mleka}} = 25\left\lbrack \text{ml} \right\rbrack*1,028\left\lbrack \frac{g}{\text{ml}} \right\rbrack = 25,7\left\lbrack g \right\rbrack = 25700\lbrack mg\rbrack$$


$$\mathbf{\%}_{\mathbf{\text{alb}}}\mathbf{=}\frac{\mathbf{7,063}\mathbf{*100\%}}{\mathbf{25700}}\mathbf{= 0,0}\mathbf{27}\mathbf{\%}$$


$$\mathbf{\%}_{\mathbf{\text{glo}}\mathbf{b}}\mathbf{=}\frac{\mathbf{9,490}\mathbf{*100\%}}{\mathbf{25700}}\mathbf{= 0,03}\mathbf{7}\mathbf{\%}$$


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
sprawko białka, Studia Chemia UW, 1 stopień, Biochemia
Bialka sprawko, Biochemia
sprawko oznaczanie zawartości białka, TŻ UR, II rok, Analiza i ocena jakości żywności
biochemia BIALKA SPRAWKO1, POLITECHNIKA ŁÓDZKA, BIOCHEMIA
bialka spr(1), Studia PŁ, Ochrona Środowiska, Biochemia, laborki, sprawka
Bialka sprawko, BIOCHEMIA
aminokwasy i białka sprawko, biochemia
Bialka sprawko, Biochemia
Białka wiążące wapń
11 Ch organiczna AMINOKWASY I BIAŁKAid 12388 ppt
BM1 Białka
04) Kod genetyczny i białka (wykład 4)
Wyklad 03 Białka3
BIOSYNTEZA BIAŁKA
Białka 08 06 05
Białka
Białka

więcej podobnych podstron