Paulina Krzemińska 30.11.2011r.
Sprawozdanie z ćwiczenia 4:
Frakcjonowanie i oznaczanie białek mleka.
Etapy procesu:
Wytrącanie kwasem octowym kazeiny, a następnie jej odsączenie (stanowi ok. ¾ białek mleka, więc musimy się jej pozbyć, aby później móc dokładnie oznaczyć zawartość albumin i globulin); w przesączu znajdowało się 25 ml serwatki.
Wytrącenie osadu globulin roztworem (NH4)2SO4 i odwirowanie go w celu oddzielenia go od albumin.
Dalsze nasycanie roztworu znad osadu, prowadzi do wytrącenia się osadu albumin, które również odwirowujemy.
Oznaczanie białek metodą Bradforda:
Jest to spektrofotometryczna metoda opierająca się na krzywej kalibracyjnej, którą tworzymy na podstawie pomiarów roztworów o znanych stężeniach, przy uprzednim pomiarze tła (roztwór soli fizjologicznej z barwnikiem).
Tworzymy roztwory białek w soli fizjologicznej, które po dodaniu odczynnika barwiącego Bio-Rad Protein Assay zmieniają kolor. Zmiana barwy polega na oddziaływaniu głównie z argininą, w mniejszym stopniu z innymi zasadowymi aminokwasami. Absorbancję mierzymy dla długości fali równej 595 nm.
Oznaczenie zawartości albumin i globulin:
Albuminy:
Przeprowadziliśmy dwie serie pomiarów krzywej kalibracyjnej, ale jedną odrzuciłam z powodu gorszej liniowości przebiegu.
Objętość dodanego wzorca [µl] | Absorbancja | Stężenie [µg/µl] |
---|---|---|
1 | 0,075 | 0,0020 |
2 | 0,091 | 0,0040 |
4 | 0,249 | 0,0079 |
6 | 0,369 | 0,0118 |
8 | 0,433 | 0,0157 |
10 | 0,550 | 0,0196 |
Stężenia albumin w poszczególnych próbkach obliczyłam według schematu:
$$c = \frac{1,98\left\lbrack \frac{\text{μg}}{\text{μl}} \right\rbrack*1\mu l}{1000\mu l + 1\mu l} = 0,0020\lbrack\frac{\text{μg}}{\text{μl}}\rbrack$$
Poniższy wykres przedstawia krzywą kalibracyjną wraz z jej równaniem:
Absorbancja mojej próbki wynosiła 0,107, więc jej stężenie to 0,00339 [µg/µl].
Globuliny:
W poniższej tabeli zestawiamy wyniki pomiarów spektrofotometrycznych lepiej dopasowanej krzywej dla globulin:
Absorbancja | Stężenie [µg/µl] |
---|---|
-0,09 | 0,0011 |
0,038 | 0,0022 |
0,058 | 0,0044 |
0,096 | 0,0066 |
0,178 | 0,0088 |
0,181 | 0,0110 |
Stężenie liczyłam taką samą metodą jak dla albumin, z tym, że stężenie globulin wynosiło 1,11 [µg/µl]
$$c = \frac{1,11\left\lbrack \frac{\text{μg}}{\text{μl}} \right\rbrack*1\mu l}{1000\mu l + 1\mu l} = 0,0011\lbrack\frac{\text{μg}}{\text{μl}}\rbrack$$
Krzywa kalibracyjna dla globulin (odrzuciłam drugi i ostatni punkt):
Absorbancja mojej próbki wynosiła 0,191, więc z równania krzywej wynika, iż jej stężenie wynosi 0,00911[µg/µl].
Obie próbki były wielokrotnie rozcieńczone, więc ich prawdziwe stężenie w mleku jest inne, niż powyżej przedstawione. Aby obliczyć prawdziwe stężenie białek musimy uwzględnić:
rozcieńczenie przy dodawaniu odczynnika (1000 ml/800ml, czyli 1,25-krotne),
rozcieńczenie przed dodaniem odczynnika barwiącego (globuliny 20-krotne, a albuminy 40-krotne),
osady globulin i albumin rozcieńczałam w 5 ml roztworu soli fizjologicznej (dzięki tej informacji jestem w stanie obliczyć masę białek w próbce,
otrzymana masa białek pochodziła z 3 ml serwatki, więc jestem w stanie policzyć zawartość białek w całej serwatce (25 ml) :
$$c_{\text{alb}} = 0,00339*1,25 = 0,00424\lbrack\frac{\text{μg}}{\text{μl}}\rbrack$$
$$c_{\text{alb}} = 0,00415*40 = 0,170\lbrack\frac{\text{μg}}{\text{μl}}\rbrack$$
$$m_{\text{alb}} = 0,170\left\lbrack \frac{\mu g}{\mu l} \right\rbrack*5000\left\lbrack \mu l \right\rbrack = 848\lbrack\mu g\rbrack$$
$$m_{\text{alb}} = 848\lbrack\mu g\rbrack*\frac{25\left\lbrack \text{ml} \right\rbrack}{3\left\lbrack \text{ml} \right\rbrack} = 7,063\lbrack mg\rbrack$$
$$c_{\text{glob}} = 0,00911*1,25 = 0,0114\lbrack\frac{\text{μg}}{\text{μl}}\rbrack$$
$$c_{\text{glob}} = 0,0114\left\lbrack \frac{\mu g}{\mu l} \right\rbrack*20 = 0,228\lbrack\frac{\mu g}{\mu l}\rbrack$$
$$m_{\text{glob}} = 0,228\left\lbrack \frac{\text{μg}}{\text{μl}} \right\rbrack*5000\left\lbrack \text{μl} \right\rbrack = 1139\lbrack\mu g\rbrack$$
$$m_{\text{glob}} = 1139\left\lbrack \text{μg} \right\rbrack*\frac{25\lbrack ml\rbrack}{3\lbrack ml\rbrack} = 9,490\lbrack mg\rbrack$$
Aby obliczyć zawartość procentową w mleku, muszę znać masę 25 ml mleka. Gęstość mleka to 1,028[g/ml]:
$$m_{\text{mleka}} = 25\left\lbrack \text{ml} \right\rbrack*1,028\left\lbrack \frac{g}{\text{ml}} \right\rbrack = 25,7\left\lbrack g \right\rbrack = 25700\lbrack mg\rbrack$$
$$\mathbf{\%}_{\mathbf{\text{alb}}}\mathbf{=}\frac{\mathbf{7,063}\mathbf{*100\%}}{\mathbf{25700}}\mathbf{= 0,0}\mathbf{27}\mathbf{\%}$$
$$\mathbf{\%}_{\mathbf{\text{glo}}\mathbf{b}}\mathbf{=}\frac{\mathbf{9,490}\mathbf{*100\%}}{\mathbf{25700}}\mathbf{= 0,03}\mathbf{7}\mathbf{\%}$$