Biotechnologia – jest interdyscyplinarną dziedziną łączącą w sobie nauki techniczne i przyrodnicze, obejmującą badanie, wytwarzanie i wykorzystanie DNA/RNA, białek/enzymów, drobnoustrojów, kultur komórkowych w procesach modyfikacji genetycznej, biosyntezy, biotransformacji, bioutylizacji a także wyodrębnianie i modyfikacje tak otrzymanych bioproduktów.
Biotechnologia tradycyjna –przebiegającą z użyciem drobnoustrojów i komórek organizmów wyższych nie zawierających obcego materiału genetycznego
Biotechnologia nowoczesna – gdzie stosowane są szczepy drobnoustrojów lub inne linie komórkowe skonstruowane metodami inżynierii genetycznej
Inżynieria genetyczna – ingerencja w materiał genetyczny organizmów, w celu zmiany ich właściwości dziedzicznych. Polega na wprowadzaniu do komórek organizmu biorcy, określonego odcinka DNA dawcy.
Biotechnologia czerwona – wykorzystywana w ochronie zdrowia i medycynie. Jest ważnym i dynamicznie rozwijającym się obszarem biotechnologii, w szczególności w zakresie produkcji nowych biofarmaceutyków, rozwoju diagnostyki genetycznej, geoterapii i
ksenotransplantologii.
Biotechnologia biała – wykorzystuje systemy biologiczne w produkcji przemysłowej. Opiera się na biokatalizie i bioprocesach. Surowce odnawialne są tu przekształcane z wykorzystaniem pleśni, drożdży, bakterii, enzymów w cenne chemikalia, leki, biopolimery, czynniki energetyczne, funkcjonalne, składniki żywności.
Biotechnologia zielona – związana jest z rolnictwem, obejmuje zastosowanie metod inżynierii genetycznej w celu doskonalenia produkcji roślinnej i zwierzęcej. Ważnym obszarem jest wprowadzanie transgenicznych roślin do produkcji szczepionek doustnych i rekombinowanych białek a także wykorzystanie tychże roślin jako surowców odnawialnych w biorafineriach.
Różnica pomiędzy tradycyjną a nowoczesną biotechnologią – w obu występuje przenoszenie genów, ale w tradycyjnej nie wiadomo jaki gen został przeniesiony, a w nowoczesnej stosuje się techniki laboratoryjne w celu przenoszenia genów.
Fermentacja – z punktu widzenia biochemii drobnoustrojów pojęcie to wiąże się z metabolizmem beztlenowym w którym energotwórcze procesy utleniania substratu węglowego przebiegające z wydzieleniem CO2 nie wymagają tlenu cząsteczkowego jako końcowego akceptora elektronów.
W praktyce biotechnologicznej fermentacja służy do określenia przemian chemicznych w wyniku aktywności metabolicznej drobnoustrojów, czyli obejmuje zarówno fermentacje beztlenowe (np fermentacja alkoholowa) jak również tlenowe (fermentacja octowa).
Mikroorganizm – organizm obserwowany dopiero pod mikroskopem. Mikroorganizmami są bakterie, archeany, pierwotniaki i niektóre grzyby.
Proces biotechnologiczny – przyjęto nazywać zapis wszystkich czynności występujących po sobie w określonej kolejności, powodujących przemiany fizyczne, chemiczne, biochemiczne surowców oraz materiałów i prowadzących do otrzymania pożądanego produktu. Opracowanie procesu technologicznego wymaga wyszczególnienia procesów i operacji jednostkowych, określenia substratów i materiałów pomocniczych, sposobu oczyszczania i konfekcjonowania produktu jak również planu zagospodarowania bądź utylizacji odpadów
Kierunki prac biotechnologicznych –
Program opracowywania procesu biotechnologicznego, etapy – -przygotowanie technologii na przykładzie procesu biosyntezy mikrobiologicznej -proces obejmuje zarówno prace badawcze jak i prace wdrożeniowe Ogólnie można wyróżnić 6 etapów opracowania procesu 1. pozyskiwanie odpowiednich drobnoustrojów (scrining) 2. wstępne ustalenie warunków hodowli 3. doskonalenie cech produkcyjnych szczepów 4. optymalizacja procesu 5. powiększenie skali procesu 6. uruchomienie produkcji
Komórka prokariotyczna – komórka z reguły niewielka i złożona z otaczającej ściany i błony komórkowej oraz cytoplazmy, w której występują nieliczne organella. Wszystkie organizmy prokariotyczne są jednokomórkowe. Nie posiadają jądra komórkowego. Jego funkcję zastępuje nukleoid (genofor). Materiał genetyczny nie jest oddzielony od reszty komórki żadną błoną. Jest zawieszony w tzw. obszarze jądrowym cytoplazmy.
Komórka eukariotyczna – komórka mająca jądro komórkowe ograniczone otoczką jądrową, zawierające DNA z histonami upakowane w chromosomy
Przepływ informacji genetycznej w komórce –
Jądro – Rolą jądra komórkowego jest przechowywanie informacji zawartej w DNA, jej powielanie w procesie podziału komórki, a także kontrolowanie całości metabolizmu komórki dzięki kopiowaniu fragmentów DNA (kopiami są tu odcinki RNA) odpowiednich dla syntezy potrzebnych enzymów czy innych cząsteczek. Jądro otoczone jest podwójną białkowo-lipidową błoną. Poprzez pory w tejże błonie do cytoplazmy przenoszone są tylko fragmenty RNA; DNA nie opuszcza jądra.
Chromosom – forma organizacji materiału genetycznego wewnątrz komórki.
Gen – fragment DNA nadający komórce zdolność do tworzenia jakiegoś RNA (różnych mRNA, tRNA, rRNA i in.), a pośrednio kodujący zwykle także jakieś białko. Gen decyduje o przekazywaniu poszczególnych dziedzicznych cech organizmu.
Genom – materiał genetyczny zawarty w podstawowym (monoploidalnym) zespole chromosomów.
Ekspresja genu – proces, w którym informacja genetyczna zawarta w genie zostaje odczytana i przepisana na jego produkty, które są białkami lub różnymi formami RNA.
DNA – wielkocząsteczkowy organiczny związek chemiczny należący do kwasów nukleinowych. Występuje w chromosomach i pełni rolę nośnika informacji genetycznej organizmów żywych. DNA jest liniowym, nierozgałęzionym biopolimerem, dla którego monomerem są nukleotydy.
Nukleozyd – są zbudowane z zasady heterocyklicznej (adenina,cytozyna,guanina,uracyl,tymina) i odpowiedniego cukru deoksyrybozy lub rybozy w zależności od tego w skład którego biopolimeru wchodzą DNA czy RNA
Nukleotyd – połączenia rybozy lub deoksyrybozy, zasady purynowej albo pirymidynowej i kwasu fosforowego.
Zasada heterocykliczna – związek organiczny wchodzący w skład nukleozydu.
Komplementarne pary Watsona-Cricka –
Podwójna helisa DNA – model struktury DNA w postaci podwójnej helisy zaproponowany w 1953 przez Jamesa D. Watsona i Francisa H. C. Cricka. Podwójna helisa stanowi podstawowy element struktury przestrzennej cząsteczki DNA. Składa się z dwóch łańcuchów polinukleotydowych, które biegną w przeciwnych kierunkach i owijają się wokół wspólnej osi. Zasady azotowe nukleotydów znajdują się wewnątrz podwójnej helisy i są połączone wiązaniami wodorowymi w pary komplementarne.
Replikacja – jest to powielanie materiału genetycznego.
Polimeraza DNA – enzym katalizujący syntezę DNA w czasie replikacji lub naprawy DNA.
Ligaza – enzym restrykcyjny, łączący odcinki DNA
Transkrypcja – w genetyce oznacza proces syntezy RNA na matrycy DNA przez różne polimerazy RNA. Jest to, zatem przepisywanie informacji zawartej w DNA na RNA.
mRNA – cząsteczki informacyjne RNA powstające jako kopie odcinków DNA podczas transkrypcji w biosyntezie białka.
Ekson – odcinek genu podzielonego sekwencji zawierając informacje o strukturze białka koduje kolejność aminokwasów w białkach
Intron – są to fragmenty, które nie kodują żadnego białka (sekwencja pozbawiona informacji o strukturze białka).
Kod genetyczny – to zasada, według której informacja genetyczna, zawarta w DNA lub RNA, w komórkach wszystkich organizmów może ulegać "tłumaczeniu" na kolejność aminokwasów w białkach w procesie translacji. Kod genetyczny jest: kodem trójkowym, zdegenerowany, bezprzecinkowy, uniwersalny, jednoznaczny, kodony nie zachodzą na siebie.
Kodon – jednostka informacji genetycznej; 3 kolejne nukleotydy w łańcuchu DNA lub mRNA, wyznaczające rodzaj i miejsce 1 aminokwasu w łańcuchu polipeptydu podczas biosyntezy białka w komórce.
Kodony synonimowe – kodony określające ten sam aminokwas.
Degeneracja kodu genetycznego – nadmiarowość kodu genetycznego, przejawiająca się tym, że określony aminokwas jest kodowany przez więcej niż jeden kodon
Mutacja – jest to nagła zmiana materiału genetycznego. Mutacja może być wywołana samorzutnie, lub przez czynniki zewnętrzne.
tRNA – rybosomowy RNA. Cząsteczki kwasu rybonukleinowego wchodzące w skład rybosomów, biorących udział w procesie biosyntezy polipeptydów.
Antykodon – 3 kolejne nukleotydy tRNA, stanowiące jednostkę czynną w procesie syntezy białka w komórce.
rRNA – rybosomowy RNA. Cząsteczki kwasu rybonukleinowego wchodzące w skład rybosomów, biorących udział w procesie biosyntezy polipeptydów
Rybosom – organelle służące do produkcji białek w ramach translacji.
Technologia rekombinacyjnego DNA, schemat – DNA klonowany(gen)- (izolacja z genami dawcy, resynteza na matrycy RNA, synteza chemiczna) + wektor (plazmidowy, fagowy, kosmid)=DNA zrekombinowany =( transformacja)=komórka biorcy>[klonowanie]=(ekspresja nowej informacji genetycznej)=Białko.
Rekombinowany DNA – DNA zawierający wprowadzone za pomocą wektorów dane sekwencje zasad tworzące gen.
Wektor – Wektory czyli przenośniki genów
Wprowadzenie pożądanego genu do wybranego mikroorganizmów wymaga włączenia go do większej cząstki DNA którą transformuje się komórkę biorcy. W tym celu stosuje się wektory
-plazmidowe
-fagowe
-kosmidowe (hybrydy składające się DNA plazmidowego i sekwencji cos faga lambda)
Klonowanie – to proces tworzenia organizmów mających taką samą informację genetyczną.
Klon – - komórki będące swoimi wiernymi kopiami (o jednakowym składzie genetycznym).
Retrowirus – - rodzina wirusów, których materiał genetyczny zawarty jest w RNA. Najdokładniej poznanym retrowirusem jest wirus HIV.
Odwrotna transkryptaza – - proces syntezy komplementarnej nici DNA na matrycy wirusowego RNA, katalizowany przez enzym zw. odwrotną transkryptazą.
Enzymy restrykcyjne – enzymy z grupy endonukleaz wykazujące dużą specyficzność substratowi. Rozpoznają one specyficzne krótkie sekwencje nukleotydowi(zwykle 4 do 6 par zasad)i przecinają nić DNA w obrębie sekwencji w ściśle określonych miejscach. Enzymy restrykcyjne rozpoznają specyficzne sekwencje i rozcinają DNA pozostawiając w miejscu rozcięcia kohezyjne lub tępe jego końce. Końcowe fragmenty enzymów restrykcyjnych DNA można połączyć za pomocą ligazy, uzyskując w ten sposób nowe zrekombinowane cząsteczki DNA.
Sekwencja palindromowa – jest to sekwencja rozpoznawana przez enzymy restrykcyjne. Odczytywana z nici nonsensownej i sensownej jest taka sama.
5' A A T T 3'
3' T T A A 5'
„Lepkie końce” – kohezyjne końce fragmentu DNA, pociętego przez enzymy restrykcyjne w ten sposób, że cięcia przesunięte są względem siebie o kilka nukleotydów.
cDNA – komplementarny DNA, cząsteczka DNA będąca kopią sekwencji mRNA.
Plazmid – dwuniciowa, kolista cząsteczka DNA naturalnie występująca w niektórych bakteriach. Stosowana jako wektor w inżynierii genetycznej.
Miejsce wielokrotnego klonowania –
Marker selekcyjny –
Bakteriofag – wirus atakujący bakterie, zbudowany z otoczki białkowej, w której znajduje się materiał genetyczny.
Kosmid – sztucznie wytworzone wektory używane w inżynierii genetycznej. Tworzy się je łącząc plazmidy z sekwencją cos bakteriofaga lambda. ksenotransplantologii.
PCR – (Polymerase Chain Reaction) – łańcuchowa reakcja polimerazy, metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki.
Polimer PCR –
Polimeraza Taq. – Optymalna temperatura polimeryzacji dla tego enzymu to 70-79°C. Enzym zachowuje zdolność polimeryzacji po wielokrotnym ogrzewaniu do temp 95°C (taka temperatura jest wymagana do przeprowadzenia denaturacji dwuniciowego DNA). Dzięki tym właściwościom polimerazy Taq proces powielania DNA udało się zautomatyzować. Proces ten polega na umieszczeniu próbki powielanego DNA w objętości nie większej niż 0,1ml. Proces składa się z trzech etapów:
1.denaturacja podwójnej helisy DNA zachodzi w temperaturze 95°C przez 15-30sek
2.renaturacja (wiązanie hybrydyzacja starterów) Mieszaninę szybko się chłodzi do określonej temperatury, w której startery
3.elongacja (właściwy etap syntezy DNA na matrycy DNA). Temperaturę mieszaniny podwyższa się zwykle do 72°C i utrzymuje przez zadany okres czasu aby umożliwić polimerazie skopiowanie każdej jednoniciowej matrycy
Termocykler –
Polimorfizm fragmentów restrykcyjnych –
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych – to zjawisko spontanicznego łączenia się komplementarnych nici kwasó nukleinowych. Komplementarne nici kwasów nukleinowych ulegają rozdzieleniu(denaturacji) pod wpływem wysokiej temperatury lub substancji chemicznych takich jak foramid i mocznik. Po usunięciu wpływu czynnika denaturującego nici łączą się ponownie, czyli ulęgają denaturacji. Jeśli do takiej mieszaniny wprowadzi się obce nici kwasu nukleinowego oprócz wyjściowych cząsteczek powstaną cząsteczki hybrydowe, stąd nazwa hybrydyzacji. Szybkość hybryd zależy między innymi od długość fragment kwasów nukleinowych, podobieństwa i różnorodności sekwencji w próbce poddanych hybrydyzacji.
Insulina – hormon peptydowy o działaniu ogólnoustrojowym, odgrywający rolę głównie w metabolizmie węglowodanów, lecz także białek i tłuszczów.
GMO – (genetically modified organisms) - rośliny i zwierzęta zawierające w swych komórkach włączony do genomu gen obcego gatunku; uzyskiwane metodami inżynierii genetycznej.
Protoplasty – aktywna metabolicznie część komórki bakterii, grzyba lub rośliny czyli część komórki bez ściany komórkowej.
Elektroporacja – zastosowanie pola elektrycznego do odwracalnego uszkodzenia błony komórkowej w celu dokonania transformacji komórek (bakteryjnych lub grzybowych) lub protoplastów roślinnych.
Lipofekcja – transfekcja liposom ami zawierającymi DNA lub RNA.
Mikroiniekcja – roztwór DNA jest wstrzykiwany bezpośrednio do jądra komórkowego, lub w przypadku RNA do cytoplazmy, za pomocą specjalnie spreparowanej szklanej kapilary.
Plazmid Ti – Czynnik dziedziczny pozachromosomowy, istniejący autonomicznie i dziedziczący się niezależnie od chromosomów. Najczęściej plazmidy występują w ciele bakterii w postaci kolistych DNA. Plazmidem często wykorzystywanym w biotechnologii roślinnej jest plazmid Ti, pochodzący z bakterii Agrobacterium tumefaciens.
Insulina ludzka – Produkowany w trzustce polipeptyd zbudowany z 51 aminokwasów. Mimo że jej masa cząsteczkowa wynosi około 6000Da to często zaliczana jest do białek z uwagi na łatwość z jaką z cynkiem lub innymi jonami krystalizuje w postaci dimerów lub heksamerów. Insulina wykazuje szerokie spektrum aktywności biologicznej:
-obniża poziom glukozy we krwi
-wzmaga biosyntezę aminokwasów, białek i kwasów tłuszczowych
-wpływa na wnikanie glukozy do tkanek tłuszczowych i mięśni.
Insulina rekombinowana –
Gensulin –
1. Przedmiot biotechnologii. Definicja, różnica między biotechnologią tradycyjną a nowoczesną (inżynieria genetyczna), rys historyczny, zakres i znaczenie współczesnej biotechnologii.
Biotechnologa to zintegrowane zastosowanie wiedzy i techniki w dziedzinach biochemii mikrobiologii i nauk inżynierskich w celu technologicznego wykorzystania drobnoustrojów, kultur tkankowych lub ich części oraz molekularnych analogów dla pozyskania produktów i usług. W związku z pojawieniem się metod pozwalających na ingerowanie w naturalny materiał genetyczny drobnoustrojów przyjęto powszechnie podział biotechnologii na
-tradycyjną -przebiegającą z użyciem drobnoustrojów i komórek organizmów wyższych nie zawierających obcego materiału genetycznego
-nowoczesną gdzie stosowane są szczepy drobnoustrojów lub inne linie komórkowe skonstruowane metodami inżynierii genetycznej.
I okres przedpasteurowski (do połowy XIXw) procesy fermentacyjne produkcja piwa, wina, octu, chleba, napojów mlecznych. Wprowadzenie procesu inokulacji – szczepienia kolejnych cykli fermentacji częścią produktu finalnego lub ubocznego.
II okres przejściowy (początki nowych technologii mikrobiologicznych. Naukowe poznanie procesów mikrobiologicznych. W 1857r L Pateur wyjaśnił rolę drobnoustrojów w procesie fermentacji. Zastosowanie złoża zraszanego w oczyszczaniu ścieków. Nowe metody biotransformacji mikrobiologicznej orbitolu.
III okres Era nowoczesnej technologii podokres : ZŁOTA ERA ANTYBIOTYKOW nowe biotechnologie ok 100 antybiotyków w tym penicylina, a także wielu enzymów, aminokwasów, witamin nukleotydów SCP (białko paszowe), katalizatory immobilizowane podokres :WSPOŁCZESNA BIOTECHNOLOGIA manipulacja genami poza komórką Nastąpił rozwój metod rekombinacji DNA in vitro, in vivo. Mikrobiologiczna produkcja insuliny, hormonu wzrostu, białek odpornościowych metody klonowania i rozmnażania oślin in vivo.
Wymień i krótko scharakteryzuj etapy w opracowaniu procesu biotechnologicznego (relacje między nauką a technologią).
PROGRAM OPRACOWANIA PROCESU BIOTECHNOLOGICZNEGO
-przygotowanie technologii na przykładzie procesu biosyntezy mikrobiologicznej
-proces obejmuje zarowno prace badawcze jak i prace wdrożeniowe Ogolnie można wyrożnić 6 etapow opracowania procesu
1 Pozyskiwanie drobnoustrojów – poszukiwanie odpowiednich drobnoustrojow
prowadzących określony bioproces lub wytwarzających określony bioprodukt charakterystyka materiału biologicznego. Znajomość: mikrobiologia, biochemia, biologia komorki
2 dobór warunków hodowli – stworzenie warunkow zapewniających szczepom
maksymalną produkcję. Na tym etapie ustala się rownież metody wyodrębniania i oczyszczania bioproduktow, oraz warunki tych operacji: ciśnienie, temperatura, lepkość, pobor mocy. Znajomość: mikrobiologia biochemia, biologia komorki, inżynieria
3 doskonalenie cech produkcyjnych szczepu – zwiększenie potencjału genetycznego szczepu w zakresie biosyntezy i biotransformacji, określonego substratu w ilości przewyższającej potrzeby własne drobnoustrojow od kilkuset do kilkudziesięciu tysięcy razy. Stosuje się następujące metody manipulacji genami: mutacje genetyczne, fuzję protoplastow, rekombinację DNA in vitro. Ponadto dzięki inżynierii genetycznej można konstruować szczepy, ktore syntezują bioprodukty, ktorych drobnoustroje macierzyste nigdy nie produkowały Znajomość: genetyka, biologia molekularna
4 Optymalizacja bioprocesu – Jest konsekwencją maksymalnego wykorzystania potencjału metabolicznego drobnoustrojow. Ustala się skład podłoża, warunki jego mieszania i napowietrzania, kinetyki bioprocesu i in. Często ten etap i następujące po nim są opracowywane przy użyciu techniki komputerowej Znajomość: mikrobiologia, biochemia,biologia komorki, chemia,inżynieria oraz informatyka
5 powiększenie skali – przeniesienie opracowanej w laboratorium technologii do skali połtechnicznej (fermentatory o poj. 20-1000L) Znajomość inżynieria, informatyka, matematyka, fizyka, ekonomia, ekologia
6 uruchomienie produkcji przemysłowej – przeniesienie wynikow doświadczeń laboratoryjnych, połtechnicznych do warunkow przemysłowych (fermentatory o poj. 10tys-200tys L) Znajomość jak w 5.
Schemat procesu technologii rekombinacyjnego DNA. Wymień i krótko opisz poszczególne etapy.
Podstawy biochemiczne procesów technologii rekombinacyjnego DNA
Informacja genetyczna to sekwencja zasad heterocyklicznych. Struktura DNA ilustruje podstawową zależność wspólną dla wszystkich biocząsteczek
-ścisłą zależność między strukturą a funkcją Właściwością DNA ktore pozwalają temu biopolimerowi funkcjonować jako wydajny i stabilny nośnik informacji jest struktura
-DNA jest liniowym polimerem czterech monomerów (zasad A, G, T, C)
-każdy nukleotyd składa się reszty cukrowej deoksyrybozy i grupy fosforanowej i z zasady heterocyklicznej
-rdzeń polimerowy stanowią powtarzające się reszty fosforanowo-cukrowe (rdzeń fosforanowo-cukrowy) Do każdej reszty cukrowej dołączona jest zasada heterocykliczna. Kolejność zasad oznacza sekwencję. Sekwencja stanowi informację genetyczną.
Przedstaw idee rekombinacji i klonowania DNA
Wymień podstawowe narzędzia stosowane w inżynierii genetycznej
Enzymy są narzędziami inżynierii genetycznej
-polimerazy DNA- potrafią zsyntetyzować komplementarną nić DNA wzorując się matrycą (może powielić DNA)
-odwrotna transkryptaza- synteza DNA na matrycy mRNA (synteza cDNAkomplementarny DNA) Enzym ten potrafi zsyntetyzować na matrycy RNA drugą nić ktora jest już nicią DNA. Następuje rozplecenie i do nici DNA syntezowana druga nić DNA
cDNA-geny wytworzone sztucznie na bazie mRNA za pomocą odwrotnej transkryptaza
-ligaza- enzym ktory w momencie gdy występują nici połączone lepkimi końcami łączy je na stałe Enzym łączy odcinki kowalencyjnie
Co to są i jak działają enzymy restrykcyjne
Enzymy restrykcyjne – rozpoznają sekwencje DNA i przecinają ją w danym miejscu są to tzw nożyczki molekularne Występują w bakteriach a wytworzone zostały do obrony przed bakteriofagami Każdy enzym restrykcyjny połączony jest z innymi enzymami zabezpieczającymi, dzięki czemu nie rozcinają swojego DNA Sekwencje typu palindromowego – czyli takie ktore są symetryczne. Mogą tu wystąpić trzy sposoby rozcinania:
Istnieje możliwość pocięcia DNA w sposob odwracalny, możemy łączyć je cząsteczką ktora służy nam do transformacji danego organizmu czy innego DNA.
Wymień i krótko opisz metody pozyskiwania DNA do zastosowań w technologii rekombinacyjnego DNA.
Wymień i scharakteryzuj wektory stosowane do klonowania DNA w bakteriach.
Wektory czyli przenośniki genów
Wprowadzenie pożądanego genu do wybranego mikroorganizmów wymaga włączenia go do większej cząstki DNA którą transformuje się komórkę biorcy. W tym celu stosuje się wektory
-plazmidowe
-fagowe
-kosmidowe (hybrydy składające się DNA plazmidowego i sekwencji cos faga lambda)
Struktura wektora musi być tak zaprogramowana aby poza wprowadzeniem pożądanego genu do komórki zapewnić jego
-powielenie
-stabilność
-dobrą ekspresję klonowanej cechy
-łatwą detekcję jego obecności
-ochronę zrekombinowanego DNA i produktu finalnego(białka) przed enzymatyczną degradacją
-ewentualnie transport białka poza komórkę
Plazmidy są dwuniciowymi kolistymi cząsteczkami DNA naturalnie występującymi w niektórych bakteriach.
Plazmidy posiadają własne regulatorowe sekwencje nukleotydów ori
Pojemność wektorów plazmidowych ograniczona jest sposobem wprowadzania zrekombinowanych cząstek DNA do komórek gospodarza.
Wektory plazmidowe wprowadzane są do komórek bakterii przy wykorzystaniu zjawiska transformacji.
Plazmidowe geny odporności na antybiotyki stanowią ważną cechę selekcyjną wykorzystywaną podczas klonowania i namnażania szczepów ze zrekombinowanym DNA Klonowanie w wektorze pochodnym faga.Można wstawić 20-25 tys par zasad.
Genom bakteriofaga λ jest dwuniciową cząsteczką DNA o znanej sekwencji 49502 par zasad mieszczącą ok 40 genów.
DNA który może być sklonowany w wektorach stosowanych w transformacji komórek prokariotycznych.
| Typ wektora | Dł.klonówDNA |
|---|---|
| PLAZMID | 10 (kb) |
| BAKTERIOFAG | 25 (kb) |
| KOSMID | 45 (kb) |
| YAC | 500 (kb) |
YAC-sztuczne chromosomy drożdżowe.
W dojrzałych cząsteczkach wirusowych DNA ma formę liniowej cząsteczki zakończonej 12 nukleotydowymi jednoniciowymi „lepkimi końcami”nazywanymi sekwencjami cos. Z DNA faga lambda można usunąć odcinek stanowiący około 30% genomu pozostawiając jego lewe i prawe ramie zawierające niezbędne geny w cyklu życiowym. Ponieważ do główki białkowej faga nie jest pakowany DNA o długości różniącej się o więcej niż 75-105% długości DNA faga dzikiego. Można to zjawisko wykorzystywać do selekcji zrekombinowanych cząsteczek DNA, gdyż tylko takie będą infekcyjne.
Krótkie omówienie organizmów, które są najczęściej wykorzystywane jako gospodarze do klonowania i ekspresji zrekombinowanego DNA
Jak można utworzyć bibliotekę genomową człowieka w fagu lambda?
Na czym polega wielokrotne powielenie DNA przez zastosowanie reakcji łańcuchowej polimeryzacji PCR
DNA ogrzewamy do 100°C, następuje rozplecenie nici Starter (primery) są to krotkie (najczęściej ok. 20 nukleotydow) fragmenty DNA komplementarne do matrycy Do reakcji wprowadza się matrycowy DNA, trifosforany deoksyrybonukleotydow, startery (primery), oraz termostabilną polimerazę DNA W wyższej temperaturze (zwykle około 95°C) pękają wiązania wodorowe i podwojna helisa DNA rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy. W temperaturze niższej, ściśle określonej dla danej pary starterow (pomiędzy 45-70°C), przyłączają się one do matrycy. Podwyższenie temperatury do około 72°C powoduje utworzenie się na matrycy, z przyłączonymi do niej starterami, kompleksu z polimerazą DNA, wskutek czego rozpoczyna się synteza nici komplementarnej do matrycy. Tworcą metody PCR jest Kary Mullis Metoda ta zaczęła być szeroko stosowana gdy polimerazę Klerova można było zastąpić termostabilną polimerazą z bakterii z bakterii Thermus aquaticus (polimeraza Taq) Optymalna temperatura polimeryzacji dla tego enzymu to 70-79°C Enzym zachowuje zdolność polimeryzacji po wielokrotnym ogrzewaniu do temp 95°C (taka temperatura jest wymagana do przeprowadzenia denaturacji dwuniciowego DNA) Dzięki tym właściwościom polimerazy Taq proces powielania DNA udało się zautomatyzować Proces ten polega na umieszczeniu probki powielanego DNA w objętości nie większej niż 0,1ml.
Proces składa się z trzech etapow
1 denaturacja podwojnej helisy DNA zachodzi w temperaturze 95°C przez 15-30sek
2 renaturacja (wiązanie hybrydyzacja starterow) Mieszaninę szybko się chłodzi do określonej temperatury, w ktorej startery mogą tworzyć dwuniciowe struktury hybrydowe na końcach każdej nici DNA 3 elongacja (właściwy etap syntezy DNA na matrycy DNA) Temperaturę mieszaniny podwyższa się zwykle do 72°C i utrzymuje przez zadany okres czasu aby umożliwić polimerazie skopiowanie każdej jednoniciowej matrycy.
Omów dowolny przykład zastosowania metod rekombinacji DNA z dziedziny biotechnologii medycznej (szczepionki, testy diagnostyczne).
Zastosowanie drobnoustrojow chorobotworczych (przy produkcji szczepionek) wymaga przestrzegania ścisłych przepisow i tworzone są bardzo precyzyjne mechanizmy kontroli warunkow technicznych bezpiecznego namnażania drobnoustrojow patogennych. Zagadnieniem budzącym niepokoj jest potencjalne niebezpieczeństwo związane z rozwojem inżynierii genetycznej i biotechnologii z użyciem organizmow modyfikowanych genetycznie. Dotyczy to szczegolnie szczepow konstruowanych dla rolnictwa jak również wykorzystywanych do utylizacji ściekow.
Nowoczesna biotechnologia w przemyśle spożywczym: GMO.
w skrócie GMO (ang. Genetically Modified Organisms) to organizmy, których geny zostały celowo zmienione przez człowieka. Modyfikacje, jakim podlegają organizmy można podzielić na trzy grupy
zmieniona zostaje aktywność genów naturalnie występujących w danym organizmie
do organizmu wprowadzone zostają dodatkowe kopie jego własnych genów
wprowadzany gen pochodzi z organizmu innego gatunku (organizmy transgeniczne)
Modyfikacje genetyczne budzące najwięcej kontrowersji to przeważnie wprowadzenie genów pochodzących z innych gatunków, które nadają modyfikowanemu organizmowi pożądaną cechę, nie występującą u niego naturalnie.
Główne zastosowania modyfikacji:
zmodyfikowane mikroorganizmy są używane do produkcji pewnych substancji chemicznych, takich jak np. insulina
modyfikowanie roślin pozwala dodać/wzmocnić cechy zwiększające opłacalność produkcji. Modyfikacje roślin uprawnych polegają przede wszystkim na wprowadzeniu lub usunięciu z nich określonych genów. Modyfikacje mają przede wszystkim na celu:
zwiększenie odporności na herbicydy i szkodniki,
zwiększenie odporności na infekcje wirusowe, bakteryjne i grzybowe,
zwiększenie tolerancji na stres abiotyczny (głównie zmiany klimatyczne),
przedłużenie trwałości owoców,
poprawę składu kwasów tłuszczowych oraz aminokwasów białek,
unormowanie stężenia fitoestrogenów,
zwiększenie zawartości suchej masy,
zmianę zawartości węglowodanów, karotenoidów i witamin,
usunięcie składników antyżywieniowych - toksyn, związków utrudniających przyswajanie składników, związków które podczas obróbki kulinarnej ulegają reakcjom chemicznym wytwarzając toksyny, zwiększając np. zawartość nutraceutyków, czyli substancji niezbędnych dla zdrowia,
Przykłady organizmów transgenicznych w rolnictwie:
transgeniczne pomidory o przedłużonej trwałości
transgeniczne rośliny tytoniu, odporne na herbicydy
soja transgeniczna odporna na działanie glifosatu.
Produkcja insuliny technologią zrekombinowanego DNA: opisz krótko jedno z rozwiązań.
Otrzymywanie ludzkiej insuliny z wykorzystaniem zrekombinowanych bakterii E.coli.
Generalnie problem rozwiązano na dwa sposoby:
-otrzymano metodami inżynierii genetycznej oddzielnie oba łańcuchy A i B po czym połączono je na drodze chemicznej
-wytworzenie proinsuliny która była enzymatycznie przekształcona w insulinę (sposób podobny do procesu zachodzącego naturalnie w trzustce).
W procesie technologicznym opartym na łączeniu łańcuchów A i B
-opracowano procedury wprowadzania genów do komórek bakterii, warunki hodowli zrekombinowanych organizmów oraz opracowano warunki izolacji i oczyszczania peptydów A i B
-opracowano warunki łączenia peptydów A i B w natywną cząsteczkę insuliny (tworzenie dwusiarczkowych mostków w ściśle określonych pozycjach). Produkcja ludzkiej insuliny w komórkach E.coli. Był to niezwykle trudny etap w opracowaniu technologii. W wyniku niekontrolowanego połączenia może powstać bardzo wiele izomerów w tym 3 monomery A monomer B, 57 dimerów A2 2 dimery B2 12 dimerów AB (w tym jeden będący HI) a ponadto ponad 3000 trimerów i niezliczona liczba wyższych izomerów. W praktyce w wyniku spontanicznego tworzenia mostków disiarczkowych otrzymano preparat o aktywności 1-2% naturalnej insuliny. Taka wydajność była nie do zaakceptowania w przemysłowym procesie tworzenia leku. Opracowana procedura polegała na wcześniejszym przeprowadzeniu grup tiolowych w tioestry siarczynowe, następnie reakcji łączenia łańcuchów A i B w stosunku molowym 2:1 przeprowadzonej w obecności chiralnego utleniacza zwanego odczynnikiem Clelada-DTTditiotretiol o wzorze HSCH2CHOHCHOHCH2SH. Takie warunki prowadziły do otrzymania prawidłowej cząsteczki insuliny z wydajnością 50% liczoną w stosunku do łańcucha B