Ewelina Honkisz
„Characterization of transgenic mice with the expression of phenylalanine hydroxylase
and GTP cyclohydrolase I In the skin”
1.Cel transformacji, rodzaj użytego organizmu.
- ekspresja PAH (hydroksylazy fenyloalaninowej) i GTP-CH (cyklohydrolazy I guanozynotrifosforanu) w różnych warstwach skóry, jako alternatywna metoda leczenia fenyloketonurii oraz wykorzystanie skóry do genowej terapii w leczeniu fenyloketonurii.
- wykorzystano myszy BTBR-Pahenu2 z The Jackson Laboratory
- myszy do transgenezy w celu ekspresji PAH i GTP-CH w skórze uzyskano po skrzyżowaniu linii myszy BalbCxDBA2
- wszystkie myszy były trzymane w plastykowych klatkach w atmosferze wolnej od patogenów, karmione i pojone bez ograniczeń
2. Funkcja PAH i GTP-CH
- PAH katalizuje konwersję fenyloalaniny do tyrozyny i wymaga kofaktora BH4 dla swojej katalitycznej aktywności
- GTP-CH to enzym związany z syntezą lub regeneracją tetrahydrobiopteryny BH4 – kofaktora reakcji przekształcania fenyloalaniny w tyrozynę
3. Budowa konstruktu wykorzystanego do transformacji.
- Konstrukt genowy INV-PAH i INV-GTP-CH : otrzymano za pomocą procedury trójetapowego klonowania: ludzki cDNA kodujący PAH (2,4 kb) wyizolowano z plazmidu phPAH247 oraz ludzki cDNA kodujący GTP-CH (1,15 kb) wyizolowano z plazmidu pCDM8GTP.S. Obydwa cDNA subklonowano do następujących wektorów: pBluescriptIISK i Pgem-5Zf w celu wygenerowania miejsc restrykcyjnych dla NotI i w efekcie wklonowano do wektora Ph3700-pL2.
- Konstrukt genowy K14-PAH : ludzkie cDNA kodujące PAH (2,4kb) wyizolowano z plazmidu phPAH247 i zligowano z wektorem pHK14 trawionym NotI.
- Konstrukt genowy K14-GTP-CH : metoda trójetapowego klonowania
- Konstrukt genowy K1-PAH : ludzkie cDNA kodujące PAH (2,4kb) wyizolowano z plazmidu phPAH247 i zligowano z wektorem pHK1 trawionym NotI.
- Konstrukt genowy K1-GTP-CH : metoda trójetapowego klonowania
4. Metoda transformacji i jej weryfikacja.
- transgeniczne myszy otrzymano metodą mikroiniekcji do zapłodnionego oocytu.
-obecność transgenów sprawdzono metodą PCR oraz przeprowadzono analizę RFLP (DNA uzyskano z biopsji ogona).
-ekspresję tkankowo-specyficzną transgenów zbadano metodą RT-PCR
- aktywność PAH zmierzono przez pomiar [14C]tyrozyny w ekstrakcie komórkowym.
- koncentracje fenyloalaniny w surowicy zmierzono fluorymetrycznie.
- za pomocą programu SAS przeprowadzono analizę wariancji – porównano myszy z ekspresją PAH i GTP-CH z myszami nietransgenicznymi.
5. Efekt transformacji.
- 7/36 myszy po mikroiniekcji konstruktu INV wykazywało obecność obydwóch transgenów, a 1/36 myszy posiadał tylko jeden transgen (GTP-CH)
- 4/33 myszy po mikroiniekcji konstruktu K14 wykazywało obecność obydwóch transgenów
- 4/40 myszy po mikroiniekcji konstruktu K1 wykazywało obecność obydwóch transgenów
- z powodzeniem otrzymano prawie ze wszystkich transgenicznych myszy linie wsobne z przekazaniem transgenu
6. Działanie genu w myszach po transformacji
- zachodzi ekspresja PAH i GTP-CH z promotorów INV i K14
- nie odnotowano ekspresji z promotora K1 (transgen pod kontrolą tego promotora mógł zostać włączony do tzw. cichej chromatyny lub promotor jest za słaby, żeby ekspresja pod jego kontrolą była wykrywalna)
- zidentyfikowano również ekspresję w innych narządach zawierających wielowarstwowy nabłonek płaski (przełyk, szyjka macicy, podniebienie, błona śluzowa policzka
- ekspresja z promotora K14 znacząco obniżyła poziom fenyloalaniny w 35 i 50 dniu życia myszy (ekspresja z tego promotora ma miejsce w warstwie bazalnej naskórka, czyli najbliżej położonej w stosunku do naczyń krwionośnych)