Ćwiczenie „Bioreaktor mikrobiologiczny”

Cel ćwiczenia: Wyznaczanie właściwej szybkości wzrostu oraz współczynników stechiometrycznych na przykładzie szczepu Bacillus licheniformis wykorzystującego glukozę, jako źródło węgla i energii.

Wzrost mikroorganizmów to bardzo złożony proces. We wnętrzu komórek zachodzi wiele, powiązanych ze sobą przemian enzymatycznych o skomplikowanej kinetyce. Uwzględnienie wszystkich tych relacji stechiometrycznych i kinetycznych jest bardzo skomplikowane, dlatego też do opisu wzrostu mikroorganizmów wykorzystuje się jedynie najbardziej istotne zależności występujące w czasie wzrostu danej populacji.

Wzrost mikroorganizmów można rozpatrywać jako bardzo złożoną przemianę, w której tworzona jest biomasa i produkty metabolizmu.

Jednym z najważniejszych parametrów, który określa szybkość wzrostu biomasy mikroorganizmów jest właściwa szybkość wzrostu (µ) zdefiniowana jako:

(1)

gdzie: X-stężenie biomasy [g l^-1]

t – czas [h]

Wartość µ zmienia się w trakcie hodowli okresowej; jedynie w fazie wzrostu logarytmicznego (Rys.1) przyjmuje stałą, maksymalną w danej hodowli wartość.

Rys. 1 Wzrost mikroorganizmów w hodowli okresowej – przebieg zmiany stężenia substratu

i biomasy w czasie.

W fazie wzrostu logarytmicznego wzrost podlega zasadom kinetyki I rzędu względem stężenia biomasy. Równanie (1) sprowadza się do postaci (2), gdzie właściwa szybkość wzrostu jest odpowiednikiem stałej szybkości reakcji.

(2)

Po scałkowaniu równania (2) dla zakresu odpowiadającego wzrostowi logarytmicznemu uzyskuje się zależność:

(3)

gdzie: X₁, X₂- graniczne stężenie biomasy w obrębie wzrostu logarytmicznego [g l^-1]

t₁, t₂- czasy odpowiadające odpowiednio X₁, X₂ [h]

Wartość właściwej szybkości wzrostu jest zależna od szczepu mikroorganizmów, warunków fizycznych (T, pH, siła jonowa) oraz jest funkcją stężenia substratu (ów) (zwykle substratu węglowego stanowiącego główne źródło węgla i energii, nazywane substratem limitującym). Najprostszym, ale najczęściej spotykanym modelem opisującym relację właściwej szybkości wzrostu i stężenia substratu limitującego jest model przedstawiony przez Monoda:

(4)

gdzie: c_S -stężenie substratu limitującego[g l^-1]

K_S - stała Monoda [g l^-1]

µ_max – maksymalna szybkość wzrostu [h^-1]

Zależność ta, analogiczna do równania Michaelisa-Menten, przedstawiona jest schematycznie na Rys. 2.

Rys. 2 Zależność właściwej szybkości wzrostu od stężenia substratu limitującego opisana

modelem Monoda.

Stałe powyższego równania kinetycznego można wyznaczyć zarówno przy wykorzystaniu wyników z hodowli okresowej, jak i z hodowli ciągłej. Realizacja hodowli ciągłej jest znacznie bardziej skomplikowana, aniżeli hodowli okresowej, stąd przynajmniej wstępne wartości stałych wyznacza się na podstawie danych z hodowli okresowej.

Przebieg ćwiczenia:

Badania prowadzi się w termostatowanym (37^oC) bioreaktorze wyposażonym w mieszadło mechaniczne, które zapewnia pseudohomogeniczność układu, przy odpowiednim natlenieniu hodowli. Wszystkie elementy bioreaktora, jak i pożywka poddawane są uprzednio sterylizacji (121⁰C). Schematycznie układ badawczy przedstawiono na Rys. 3.

rotametr

pobór próbek

powietrze sterylne

Rys. 3 Schemat bioreaktora mieszalnikowego do hodowli wgłębnej pracującego w systemie

okresowym.

Sposób przeprowadzenia eksperymentu

Do bioreaktora o pojemności 2,5 dm³ wprowadza się 1,5 dm³ pożywki mineralnej o składzie na 1 litr: NaNO₃ 3 g, KH₂PO₄ 3 g, K₂HPO₄ 6 g, (NH₄)₂SO₄ 10 g, MgSO₄ 0,01 g, MnSO₄ 0,01 g, CaCl₂ 0,01 g, ZnSO₄ 0,001 g, FeSO₄ 0,001 g, cytrynian trójsodowy 1g i poddaje sterylizacji w autoklawie (121⁰C) przez 1h. Równocześnie w osobnym naczyniu sterylizuje się roztwór glukozy (150 g l^-1).

Hodowlę rozpoczyna się poprzez dodanie odpowiedniej ilości glukozy do sterylnej pożywki mineralnej, tak aby w poszczególnych hodowlach okresowych uzyskać stężenie początkowe cukru 1-10 g l^-1 i zaszczepienie reaktora bezpośrednio z płytki agarowej (2 pełne oczka ezy lub hodowli płynnej ok. 5% objętości reaktora).

Po dobrym wymieszaniu układu należy pobrać pierwsze próby do analizy stężenia glukozy i stężenia biomasy. Następne próby pobiera się w odstępach kilkudzięciominutowych, do momentu pełnego wyczerpania glukozy, zwracając uwagę na wysoką częstość poboru prób w fazie wzrostu logarytmicznego.

Stężenie komórek oznacza się spektrofotometrycznie poprzez pomiar mętności (OD) hodowli, przy 550 nm względem wody. Krzywa standardowa dla uzyskana metodą suchej masy dla Bacillus licheniformis opisana jest równaniem A(550nm) =4,286 ^. X [g/l], gdzie X-stężenie biomasy. Wszystkie pomiary należy wykonać przynajmniej w dwukrotnym powtórzeniu nie przekraczając wartości absorbancji 1,0.

Stężenie substratu węglowego (glukozy) oznacza się poprzez test DNS, dla prób uprzednio odwirowanych (3000 obr./min, 15 min.).

Do 0,5 ml odwirowanego medium hodowlanego należy dodać 1,5 ml odczynnika DNS i próby wstawić na 5 min. do łaźni wodnej o temp. 100⁰C. Następnie próby należy szybko ochłodzić, dodać 8 ml wody destylowanej i po 25 min od wyciągnięcia z łaźni zmierzyć absorbancję przy 550 nm względem kontroli. Próbę kontrolną uzyskuje się poprzez dodanie 0,5 ml wody destylowanej zamiast 0,5 ml medium traktując następnie próbę kontrolną, jak wszystkie pozostałe. Krzywa standardowa dla glukozy opisana jest równaniem A(550nm)=0,65 ^. c_S [g/l] -0,02. Zakres stosowalności równania 0,1-1,6 g l^-1. Jeżeli stężenie cukru w próbie pobranej z reaktora przekracza 1,6 g l^-1, przed wykonaniem testu należy rozcieńczyć je wodą destylowaną odpowiednią ilość razy.

Dla prób odwirowanych oznacza się również spektrofotometrycznie względem wody, przy 280nm stężenie białka wytwarzanego przez szczep. Krzywa standardowa opisana jest równaniem A(280nm) = 0,982 ^. c [g/l], gdzie c-stężenie białka. Wszystkie pomiary należy wykonać przynajmniej w dwukrotnym powtórzeniu nie przekraczając wartości absorbancji 1,0.

Opracowanie wyników

Wyniki uzyskane w trakcie hodowli zbiera się w formie tabelarycznej (Tab.1), z której następnie wykreśla się wykres X=f(t), c_S=f(t), c_b=f(t).

Tab.1 Zestawienie wyników analiz podczas hodowli okresowej.

	Czas hodowli [h]	A (550nm)	rozcień-czenie	X [g l^-1]	DNS(550nm)	rozcień-czenie	cS [g l^-1]	A (280nm)	rozcień-czenie	Cb [g l^-1]
1.
2.

W celu obliczenia wartości µ sporządza się dodatkowo wykres pomocniczy (Rys. 4), na którym odznacza się odcinek prostoliniowy odpowiadający najwyższej wartości µ.

Rys. 4 Zmiana stężenia komórek w czasie (wykres logarytmiczny).

Dla przedstawionego przypadku uzyskana ze współczynnika kierunkowego prostej (Rys.4) wartość µ wyniosła 0,0503 [h^-1]. Odcinek prosty został wykreślony ze stężenia biomasy w czasie 19-23,5 h hodowli. Średnie stężenie glukozy w tym przedziale czasu wynosiło 0,581 g l^-1. Uzyskaną parę punktów (0,581; 0,0503) wraz z analogicznie uzyskanymi punktami z kolejnych hodowli okresowych nanosi się na wykres przedstawiony na Rys. 5.

Rys. 5 Zależność właściwej szybkości wzrostu od stężenia substratu.

Po linearyzacji równania Monoda (równ.(5)) w prosty sposób znajduje się wartości szukanych stałych (K_s, µ_max) (Rys.7).

(5)

Dodatkowo ze zmian stężenia komórek, białka i substratu w czasie (opisując te zmiany odpowiednimi równaniami) należy wyznaczyć współczynniki stechiometryczne Y_X/S i Y_Pr/S. Należy przyjąć tylko ten zakres, dla którego widoczna jest zmiana stężenia komórek czy białka w czasie lub też jeżeli hodowla jest skończona (koniec substratu, spadek biomasy, białka) przyjąć czas trwania całej hodowli. Opisanie punktów doświadczalnych równaniami a nie liczenie po krańcowych punktach „znosi” błąd analityczny.