1. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z metodą Nelsona służącą do oznaczania stężenia cukrów redukujących. A także wyznaczenie wpływu temperatury na aktywność enzymów na przykładze reakcji hydrolizy sacharozy przez inwertazę zawartą w wyciągu drożdżowym.

1. Wstęp teoretyczny

Szybkość większości reakcji chemicznych zwiększa się wraz ze wzrostem temperatury. Im jest ona wyższa tym cząsteczki posiadają większą energię kinetyczną a co za tym idzie posiadają wystarczającą energię do zajścia reakcji. Podobnie dzieje się z reakcjami enzymatycznymi. Jednak wzrost szybkości reakcji wraz z temperaturą zachodzi tylko do momentu osiągnięcia punktu tzw. Optimum temperaturowego, ponieważ powyżej tego punktu enzym ulega denaturacji termicznej i traci swoje właściwości katalityczne. To optimum jest wartością charakterystyczną dla każdego enzymu. Na to jak temperatura wpływa na czas reakcji duży wpływ ma czas inkubacji, ponieważ enzym może wykazywać aktywność powyżej punktu optymalnego ale tylko w krótkim czasie.

Inwertaza (fruktohydrolaza α-D-fruktozofuranozydów lub α-fruktofuranozydaza) katalizuje reakcję hydrolizy sacharozy lub pochodnych glikozydów oraz reakcję przeniesienia reszty fruktozowej na inne niż woda akceptory. Aktywność hydrolityczna inwertazy jest hamowana przez alkohole i wolne heksozy. Aktywność inwertazy oznacza się wykorzystując różne właściwości cukrów redukujących i nieredukujących. W wyniku reakcji inwertazy z jednego mola cukru nieredukującego powstają 2 mole cukrów redukujących, których stężenie można oznaczyć metodą Nelsona.

1. Materiały

• Odczynniki

• Roztwór inwertazy z wyciągu drożdżowego-enzym

• 2% roztwór wodny sacharozy- substrat

• 0,005% roztwór wodny glukozy- standard (produkt)

• 1/15 M bufor fosforanowy o pH 5,6

• Odczynniki miedziowy A ( 2,4%NaKC₄H₄0₆, 5%NaHCO_3, 4%Na₂CO₃, 3,6%K₂C₂O₄)

• Odczynnik miedziowy B ( 1,3%CuSO₄*5H₂O )

• Odczynnik arseno-molibdenowy ( 5%(NH₄)₆Mo₇O₂₄*4H₂O, 4%H₂SO₄, 0,6% Na₂HAsO₄*7H₂O )

• Szkło i aparatura

• Probówki kalibrowane

• Probówki chemiczne

• Pipety automatyczne oraz tipsy

• Parafilm

• Kuwety

• Specol

• Termostat nastawiony na 40^oC

• Termostat nastawiony na 60 ^oC

• Łaźnia z lodem (4^oC )

• Zlewka i piecyk elektryczny do przygotowania łaźni wodnej na 100^oC

W doświadczeniu próbki, które miały być inkubowane w 60 ^oC były inkubowane w 55 ^oC.

1. Przebieg ćwiczenia

1. Krzywa standardowa

• Przygotowaliśmy 26 suchych probówek chemicznych podpisanych zgodnie z tabelą 1 i 2 oraz łaźnię wodną o temperaturze 100^oC

• Przygotowaliśmy odczynnik miedziowy do oznaczania stężenia glukozy: zmieszaliśmy 6ml odczynnika A z 6ml odczynnika B

• Do 16 probówek kalibrowanych, które ponumerowaliśmy zgodnie z tabelą 1 odmierzyliśmy po 0,5ml odczynnika miedziowego i pozostawiliśmy do dalszej części doświadczenia

• Do probówek 1-6 odmierzyliśmy 0,005% standardu glukozy i uzupełniliśmy do 0,5ml wodą destylowaną zgodnie z tabelą 1

1. Badania wpływu temperatury na aktywność inwertazy

• Do 10 probówek chemicznych ponumerowanych zgodnie z tabelą 2 dodaliśmy po 0,5ml 1/15 M buforu fosforanowego o pH 5,6 i po 0,5ml 2% roztworu wodnego sacharozy

• Próbki umieściliśmy w łaźniach wodnych o różnych temperaturach zgodnie z tabelą 2 i inkubowaliśmy przez 5min.

• Po wyciągnięciu probówek z łaźni do probówek nieprimowych dodaliśmy po 0,5 ml enzymu i zaczęliśmy odmierzać 10min od tego momentu. Do probówek primowych dodaliśmy po 0,5ml wody destylowanej

• Po dokładnym wymieszaniu wszystkich probówek umieściliśmy je ponownie w odpowiednich łaźniach wodnych i prowadziliśmy inkubację przez 10min ( od moment dodania enzymu )

• Po inkubacji pobraliśmy po 0,1ml każdej mieszaniny reakcyjnej i dodaliśmy do przygotowanych wcześniej probówek kalibrowanych z odczynnikiem miedziowym

• Do probówek 7,7’-11,11’ dodaliśmy po 0,4ml wody destylowanej

• Próbki 1-11’ inkubowaliśmy 20 minut w 100^oC w celu stworzenia optymalnych warunków do przebiegu reakcji z odczynnikiem miedziowym. Po tym czasie probówki oziębiliśmy pod zimną wodą

• Dodaliśmy po 0,5ml odczynnika arseno-molibdenowego i dobrze wymieszaliśmy

• Roztwory dopełniliśmy wodą destylowaną do objętości 5ml

• Odczytaliśmy absorbancję prób 1-11’ przy długości fali 660nm wobec odnośnika ( próbki 1)

1. Wyniki i obliczenia

Tabela 1.

Nr próbki	V odczynnika miedziowego [ml]	V standardu glukozy [ml]	V H2O [ml]	Próby E+S przygotowane według tabeli 2	V odczynnika arseno-molibdenowego [ml]	A­660	A660/kor/
1	0.5	-	0.5	-	0.5	odnośnik	-
2	0.5	0.1	0.4	-	0.5	0,094	-
3	0.5	0.2	0.3	-	0.5	0,230	-
4	0.5	0.3	0.2	-	0.5	0,383	-
5	0.5	0.4	0.1	-	0.5	0,483	-
6	0.5	0.5	-	Nr	V [m]	0.5	0,615
7	0.5	-	0.4	12	0.1 ml	0.5	0,256
7’	0.5	-	0.4	12’	0.1 ml	0.5	0,155
8	0.5	-	0.4	13	0.1 ml	0.5	0,313
8’	0.5	-	0.4	13’	0.1 ml	0.5	0,109
9	0.5	-	0.4	14	0.1 ml	0.5	0,501
9’	0.5	-	0.4	14’	0.1 ml	0.5	0,130
10	0.5	-	0.4	15	0.1 ml	0.5	0,660
10’	0.5	-	0.4	15’	0.1 ml	0.5	0,167
11	0.5	-	0.4	16	0.1 ml	0.5	0,151
11’	0.5	-	0.4	16’	0.1 ml	0.5	0,119

Tabela 2.

Nr próbki	V buforu fosforanowego [ml]	V sacharozy [ml]	T łaźni [^oC]	V enzymu [ml]	V H2Odest [ml]
12	0.5	5	4	0.5	-
12’	0.5	5	4	-	0.5
13	0.5	5	20(RT)	0.5	-
13’	0.5	5	20(RT)	-	0.5
14	0.5	5	40	0.5	-
14’	0.5	5	40	-	0.5
15	0.5	5	55	0.5	-
15’	0.5	5	55	-	0.5
16	0.5	5	100	0.5	-
16’	0.5	5	100	-	0.5

• Stężenie masowe użytego roztworu glukozy:

C_G^stand. = 0.005g/ml = 0.05 mg/ml

• Masa glukozy w próbkach

V₁ = 0 ml, m_G^stand.=0 μg

V₂ = 0.1 ml, m_G^stand. = 0.1ml * 0.05 mg/ml = 0.005 mg = 5μg

V₃ = 0.2 ml, m_G^stand. = 0.01 mg = 10μg

V₄ = 0.3 ml, m_G­^stand. = 0.015 mg = 15μg

V₅ = 0.4 ml, m_G^stand. = 0.02 mg = 20μg

V₆ = 0.5 ml, m_G^stand. = 0.025 mg = 25μg

• Wykres zależności absorbancji A₆₆₀ w funkcji masy glukozy m_G^stand. [μg]

• Absorbancja opisująca ilość glukozy powstałą w reakcji enzymatycznej A₆₆₀/kor/

ΔA₆₆₀/kor/ = A₆₆₀ – A’₆₆₀

A₆₆₀ – pomiar absorbancji roztworów „nieprimowanych”

A’₆₆₀ – pomiar absorbancji roztworów „primowanych” – absorbancja wynikająca z nieenzymatycznej hydrolizy sacharozy.

ΔA₆₆₀/kor/₁ = 0256 - 0,155 = 0,101

• Masa glukozy powstała w reakcji enzymatycznej m_G^P

Obliczanie masy glukozy z równania:

y = 0,0251 x

0,101 = 0,0251 x

x = 4,024= m_G¹ [μg]

• Masa glukozy zawarta w 6 ml mieszaniny reakcyjnej m_G^M

$$\frac{m^{M}}{V_{M}} = \ \frac{m^{P}}{V_{M \rightarrow P}}$$

m_G^P = masa glukozy w mieszaninie reakcyjnej

V_M = objętość mieszaniny reakcyjnej – 6ml

m_G^P = masa glukozy w próbce badanej

V_M⟶P = objętość mieszaniny reakcyjnej przeniesiona do próbki badanej 0.1ml

m_G^M = (4,024 * 6)/0.1 = 241,44[$\frac{\text{μg}*\text{ml}}{\text{ml}} = \text{μg}\rbrack$

• Liczność glukozy w mieszaninach reakcyjnych n_G^M

n_G^M = m_G^M/M_G [μmol]

M_G = 180 g/mol = 180 * 10⁶ μg/mol

1 g = 10⁶ μg

n₁ = 241,44/ 180 *10⁶ = 1,341 * 10^-5 [$\frac{\text{μg}}{\frac{\text{μg}}{\text{mol}}}$ = mol]

n₁ = 1,341 * 10^-5 mol = 13,41 μmol

• Aktywność inwertazy w badanych próbkach Akt_inwertazy

Akt = n_{substratu ­}/ t_reakcji [U]

Akt = n_substratu / (t_reakcji * V_E) [U/ml]

Akt_inwertazy = n_G^M / (t_reakcji * V_E)

n_G^M = liczność glukozy w mieszaninie reakcyjnej

t_reakcji = czas reakcji hydrolizy – 10 min

V_E = objętość enzymu dodana do mieszaniny reakcyjnej – 0.5 ml

Akt₁ = 13,41 / (10 * 0.5) = 2,682 [ μmol / (min * ml) = U/ml]

• Wykres zależności aktywności inwertazy Akt_inwertazy [U/ml] w funkcji temperatury środowiska, w jakim prowadzona była reakcja enzymatyczna.

1. WYNIKI
   

Treakcji [^oC]	A660/kor/	mG^P [μg]	mG^M [μg]	nM^G [μmol]	Aktinwertazy [U/ml]
4	0,014	0,458	27,48	0,153	0,0306
20(RT)	0,265	8,66	519,6	2,89	0,578
40	0,525	17,16	1029,6	5,72	1,144
55	0,422	13,79	827,4	4,60	0,92
100	0,062	1,99	119,4	0,663	0,133

1. Wnioski

Obecność glukozy, która jest produktem reakcji katalizowanej przez inwertazę świadczy o aktywności enzymatycznej tego enzymu. Na podstawie analizy wykresu widzimy, że do 40 °C szybkość katalizowanej reakcji zwiększa się wraz ze wzrostem temperatury. Powyżej tej temperatury aktywność zaczyna dość znacząco spadać, co świadczy o tym, że inwertaza swoje optimum działania osiąga właśnie w temperaturze 40 °C a powyżej tej temperatury ulega denaturacji cieplnej przez co dochodzi do zamiany białkowej struktury przestrzennej i inwertaza nie może dalej katalizować reakcji chemicznej. Na podstawie danych literaturowych zawartych np. w instrukcji do ćwiczenia E i F inwertaza optimum działania wykazuje właśnie w temperaturze 40 °C.