Immunoelektroforeza – łączy elektroforezę z reakcją antygen-przeciwciało (wytrącanie się precypitatu w postaci łuku precypitacyjnego); technika różnicowania białek na podstawie ich

właściwości elektroforetycznych i immunologicznych

Immunoelektroforeza - opiera się na zjawisku precypitacji wielocząsteczkowych

kompleksów antygen-przeciwciało i pozwala na detekcję obecności antygenu oraz określenie

ilości tego antygenu w próbce. W praktyce stosuje się trzy rodzaje techniki:

- immunoelektroforeza przeciwbieżna, w której elektrolit ma tak dobraną wartość pH

(około 8,6) aby immunoglobuliny nie posiadały niezrównoważonego ładunku

elektrycznego i nie podlegały działaniu sił pola elektrycznego. Próbkę zawierającą antygen

nanosi się przy katodzie aby migrowała w kierunku anody. Przy anodzie zaś nanosi się

przeciwciała, które kierują się w kierunku katody dzięki zjawisku elektrosomozy.

W miejscu kontaktu przeciwciał z antygenem dochodzi do powstawania

wielkoczasteczkowych kompleksów i ich precypitacji. Jest to widoczne bez barwienia jako

mleczno-opalizujące linie. Po wybarwieniu linie precypitacji widoczne są na tle innych

prążków.

- Elektroforeza strefowa z immunodyfuzją, w której najpierw prowadzi się zwykła

separację strefową (często w warunkach natywnych), a po zakończeniu rozdziału z obu

stron w kierunku prostopadłym do separacji elektroforetycznej podaje się na nośnik

przeciwciała. W wyniku dyfuzji rozdzielonych białek oraz naniesionych przeciwciał

dochodzi do kontaktu antygenu z przeciwciałem i powstawania wielkocząsteczkowych

kompleksów, które precypitują w miejscu powstania w postaci charakterystycznych łuków.

Metoda pozwala również na identyfikację antygenu a intensywność linii precypitacji

i odległość od naniesionego przeciwciała świadczy o ilości antygenu.

- Immunoelektroforeza rakietowa - prowadzona jest w nośniku elektroforetycznym

wysyconym badanym przeciwciałem w warunkach pH=pI przeciwciała. W kierunku od

katody do anody elektroforetycznie migruje próbka zawierająca antygen. W miejscu

kontaktu antygen-przeciwciało dochodzi do precypitacji wielkocząsteczkowych

kompleksów. W wyniku tego powstają charakterystyczne linie o kształcie startującej

rakiety. Technika pozwala określić ilość antygenu przez porównanie powierzchni zawartej

pod krzywą. Technika ta doczekała się szeregu modyfikacji, w tym separacji

dwukierunkowej.

METODY IMMUNOELEKTROFORETYCZNE

Większość odmian immunoelektroforezy przebiega w 2 etapach:

Elektroforezy żelowej – roztwór antygenu lub mieszaniny antygenów nanosi się do studzienek w żelu agarozowym i umieszcza się w polu elektrycznym (rozdział w zależności od ich ruchliwości elektroforetycznej)

Immunoprecypitacji – obecnoć antygenów jest wykrywana za pomocą specyficznych przeciwciał – tworzą się nierozpuszczalne immunoprecypitaty. Etap ten może być realizowany podczas:

swobodnej immunodyfuzji obydwu reagentów (immunoelektroforeza prosta)

w miejscu położenia antygenu w żelu w wyniku immunoprecypitacji przez przeciwciało in situ (immunofiksacja)

wymuszonej wędrówki antygenu w polu elektrycznym przez żel zawierający przeciwciała (immunoelektroforeza rakietowa, immunoelektroforeza dwuwymiarowa)

I. Immunoelektroforeza prosta (IEP)

Elektroforeza antygenów w żelu agarozowym, a następnie swobodna immunodyfuzja antygenów rozdzielonych podczas EF i przeciwciał dodawanych w etapie drugim (do rowka w żelu biegnącego równolegle do kierunku rozdziału elektroforetycznego). Antygeny tworzą precypitaty ze specyficznymi, komplementarnymi przeciwciałami (skierowanymi wybiórczo przeciwko poszczególnym białkom). W miejscu spotkania antygenu i przeciwciała tworzą się łuki precypitacyjne. Każda linia precypitacyjna powstaje niezależnie, w wyniku indywidualnej reakcji komplementarnej pary antygen-przeciwciało.

Ocena uzyskanego preparatu opiera się na porównaniu położenia i kształtu łuków precypitacyjnych utworzonych przez analizowane białka z odpowiadającymi im łukami w płynie wzorcowym (np. surowicy zdrowego człowieka) powstałymi podczas tego samego badania i w tych samych warunkach.

Przy ocenie bierze się pod uwagę zmiany jakościowe i ilościowe, które mogą być wyrażone przez:

- obecność lub brak linii precypitacyjnej

- szerokość, kształt, położenie łuku, ostrość linii

- intensywnośc barwy precypitatu

- zmiany w ruchliwości elektroforetycznej linii precypitacyjnej

- pojawianie się łuków dodatkowych

Zastosowanie immunoelektroforezy prostej:

- wykrywanie zaburzeń w biosyntezie białek

- wykrywanie dysproteinemii

- potwierdzenie paraproteinemii

- identyfikacja białka monoklonalnego

II. Immunofiksacja (IFE)

Metoda, w której po elektroforezie antygenów w żelu agarozowym następuje ich immunoprecypitacja in situ. Metoda ta służy do:

- identyfikacji i charakterystyki białek płynów ustrojowych (wykrywanie dysprotein)

- identyfikacja i charakterystyka patologicznych immunoglobulin w surowicy, moczu,

płynie mózgowo-rdzeniowym np. białka monoklonalnego w szpiczaku mnogim

Wykonanie:

- nałożenie analizowanej próbki (surowicy, moczu) w odpowiednich rozcieńczeniach i

identycznej ilości w kilku (najczęściej 6) miejscach startowych

- podczas elektroforezy następuje rozdział białek na frakcje – uzyskuje się identyczny

rozdział na wszystkich ścieżkach

- jedna z dróg rozdziału stanowi rozdział referencyjny dla danego pacjenta (utrwala się go i barwi)

- powierzchnie pozostałych ścieżek pokrywa się roztworami swoistych przeciwciał

- przeciwciała dyfundują w głąb żelu i tworzą immunoprecypitaty z odpowiadającymi im antygenami (pod warunkiem, że antygen jest obecny i reakcja zachodzi w proporcjach ekwimolarnych

- po wypłukaniu nadmiaru reagentów (przeciwciał, białek) żel się suszy i barwi (barwienie ujawnia tylko te białka, które uległy immunofiksacji na skutek immobilizacji w żelu przez swoiste przeciwciało dowodząc, lub nie obecności antygenu

III. Immunoelektroforeza rakietowa według Laurella

Połączenie dwóch technik: radialnej immunodyfuzji i elektroforezy. Jest to metoda ilościowa pozwalająca na bezpośrednie oznaczenie stężenia antygenu białkowego w badanym materiale biologicznym. Antygen przemieszcza się w żelu zawierającym unieruchomione przeciwciała – stężenie antygenu określa się na podstawie wysokości szczytów precypitacyjnych powstałych wtedy, gdy antygen zostanie w całości związany przez przeciwciała.

Do dołków wyciętych z jednej strony płytki nanosi się roztwory antygenów badanych, wzorcowych i kontrolnej (pH układu wynosi 8,0-8,6). Po umieszczeniu płytki w polu elektrycznym antygeny wędrują do anody wiążąc się po drodze z przeciwciałami znajdującymi się w żelu. Po zakończeniu elektroforezy obserwuje się powstawanie kompleksów antygen-przeciwciało (w strefie równowagi) w postaci rakiet. Wysokość i pole powierzchni pod powstałą rakietą są wprost proporcjonalne do stężenia antygenu w próbie.

Immunoelektroforeza rakietowa nie jest stosowana do oznaczania immunoglobulin ponieważ nie wędrują lub wędrują bardzo słabo w warunkach oznaczenia = ich punkty izoelektryczne są zbliżone lub równe pH użytego buforu.

IV. Immunoelektroforeza dwuwymiarowa (immunoelektroforeza krzyżowa)

Modyfikacja metody rakietowej. Składa się z dwóch etapów: elektroforezy w żelu agarozowym, a następnie elektroforezy rozdzielonych składników w pierwszym etapie w żelu II wymiaru, zawierającym specyficzne przeciwciała.

Wykonanie:

- rozdział elektroforetyczny mieszaniny antygenów w żelu agarozowym (elektroforeza

I wymiaru)

- po jej zakończeniu żel tnie się na paski odpowiadajże ścieżkom z rozdzielonymi

białkami

- paski żelu przenosi się i układa pod kątem 90° na brzegu drugiej płytki

- na niewypełnioną paskami powierzchnię płytki wylewamy żel agarozę zawierającą specyficzne przeciwciała

- białka próby badanej ponownie poddaje się elektroforezie (w warunkach EF przeciwciała nie poruszają się w polu elektrycznym) – jest to elektroforeza II wymiaru (jej kierunek jest prostopadły do kierunku EF I wymiaru)

- antygeny wędrują w żelu i wiążą się z przeciwciałami – tworzą się linie immunoprecypitacyjne (każde biało tworzy precypitat oddzielnie)

- płytkę płucze się, suszy i barwi

Zastosowanie:

- wykrywanie dysproteinemii

- charakterystyka antygenów

Immunoelektroforeza

➔ Metoda dwuetapowa

1. elektroforeza wysokoprądowa – w czystym 1% żelu agarozowym na płytce wycina się jedną

lub dwie studzienki i nakrapla się mieszaninę antygenów. Następnie przeprowadza się

rozdział białek w polu elektrycznym. Dzięki wysokiemu pH roztworu (pH 8,6-8,8) białka

naładowane dodatnio wędrują do elektrody ujemnej, a naładowane ujemnie do elektrody

dodatniej.

2. Podwójnej immunodyfuzji – wycina się w żelu podłużny rowek równoległy do kierunku

migracji, wypełnia się go surowicą odpornościową, zawierającą przeciwciała przeciwko

poszukiwanym antygenom, a płytkę umieszcza się w komorze wilgotnej na 24 godz.

Zachodzi podwójna immunodyfuzja i w miejscu reakcji powstają łuki precypitacyjne,

odpowiadające poszczególnym antygenom wykrytym w mieszaninie.

➔ metoda czuła i swoista

➔ pozwala ocenić antygeny i przeciwciała jakościowo

➔ pozwala na porównanie złożonych mieszanin antygenów np. obecnych w surowicy krwi;

➔ stosuje się ją zwłaszcza dla wykrycia zmian w poszczególnych klasach immunoglobulin, u

chorych agammaglobulinemią lub hipergammaglobulinemią, w rozpoznawaniu niedoborów

odpornościowych i innych zaburzeń składu białek w płynach ustrojowych.

Immunoelektroforeza przeciwprądowa

➔ metoda oznaczeń elektroforetycznych w żelu

➔ pH 8.0, przeciwciało ma ładunek dodatni, a testowany antygen ładunek ujemny

➔ po umieszczeniu w polu elektrycznym antygen i przeciwciało zbliżają się do siebie, tworząc

w miejscu zetknięcia linię precypitacyjną

➔ jest bardzo szybka (ok. 30 min.) i czulsza od podwójnej immunodyfuzji około 10-20 razy

➔ zastosowanie w diagnostyce chorób zakaźnych, do wykrywania antygenów grzybiczych,

bakteryjnych, a także do wykrywania antygenu wirusowego zapalenia wątroby (Hbs).

Immunoelektroforeza rakietkowa wg Laurella

➔ metoda ilościowa oceny antygenów

➔ oznaczanie stężenia antygenu – elektroforeza w żelu zawierającym przeciwciałami

➔ odpowiednie pH (ok. 8,6) – przeciwciała nie posiadają ładunku (pH zbliżone do ich punktu

izoelektrycznego), a antygen ma ładunek ujemny

➔ antygen wędruje ku katodzie, tworząc w miejscu zetknięcia z przeciwciałem precypitat o

kształcie rakietki (stąd nazwa)

➔ pole powierzchni ograniczonej rakietką jest wprost proporcjonalne do ilości badanego

antygenu. Wartość badanych próbek oblicza się z krzywej wzorcowej (czułość ok. 0,3

mg/ml). Immunoelektroforeza krzyżowa

➔ pozwala na identyfikację antygenu występującego w małych ilościach w mieszaninie białek

➔ metoda dwuetapowa:

1. elektroforeza wysokoprądowa antygenu nałożonego na studzienkę,

2. pasek żelu zawierający rozdzielone białka (ścieżkę rozdziału) przenosi się na drugą płytkę.

Powierzchnię płytki nad paskiem pokrywa się agarozą z przeciwciałem, zaś powierzchnie

pod paskiem czystą agarozą i prowadzi elektroforezę niskoprądową w kierunku

prostopadłym do pierwszego. Antygeny wędrując przez żel spotykają na swej drodze

unieruchomione przeciwciała tworząc najpierw migrujące kompleksy, a następnie w strefie

ekwiwalencji, łuki precypitacyjne o wysokości proporcjonalnej do stężenia antygenu.

➔ Metoda bardzo czuła

➔ pozwala na wykrycie i ocenę białek występujących w bardzo małych ilościach

➔ porównywanie antygenów, wyodrębnianie badanego antygenu z mieszaniny,

➔ identyfikacja alergenów zdolnych do swoistego wiązania

➔ IgE z surowicy chorych