Immunohistochemia -wykrywanie sub. a/genowych w skrawkach mikroskopowych, stosowane w histopatologii i histologii. Zastosowanie przeciwciał skierowanego przeciwko poszukiwanemu składnikowi preparatu, a następnie systemu detekcji, tworzenie barwną, nierozpuszczalną sub, widoczną w mikroskopie

Antygen- substancja, która wykazuje:
-immunogenność, czyli zdolność do wywołania przeciwko sobie odpowiedzi odpornościowej lub
-antygenowość, czyli zdolność do wiązania się ze swoistymi przeciwciałami.

Wyróżniamy 5 klas immunoglobulin z których ważny w immunohistochemiii są IG E oraz IgG

Schemat przeciwciała:
1. fragment wiążący antygen
2. region Fab
3. region Fc
niebieskie – łańcuchy ciężkie
żółte – łańcuchy lekkie
ciemnoniebieskie/żółte – regiony zmienne
jasnoniebieskie/żółte – regiony stałe
szare – mostki dwusiarczkowe

Ta cześć przeciwciała, która wiąże antygen -paratop
Ta część antygenu, która wiązana jest do p/ciała -epitop
Przeciwciała:
-poliklonalne-skierowane przeciwko jednemu a.genowi, ale przeciw jego wielu determinantom (epitopom)
-monoklonalne-przeciwko jednemu epitopowi antygenu
Produkcja przeciwciał: w odstępach kilkudniowych lub kilkutygodniowych wstrzykujemy zwierzęciu lab. a/gen. Następnie pobieramy od zwierzęciu surowicę. Immunoglobuliny wytracamy siarczanem sodu lub amonu. Oddzielamy na drodze dializy i oczyszczamy przez rozdział chromatograficzny
Przeciwciała monoklonaln:
1. Immunizacja zwierzęcia
2. Pobieranie śledziony zwierzęciu (dużo limf. B)
3.Przeprowadzenie fuzji wyizolowanych limf. B z kom szpiczaka i tak otrzymujemy kom produkujące przeciwciało
4.Selekcja kom. prod. pożądane p/ciała i ich namnożenie. Kom. produkują przeciwciała i wydzielają je do pożywki skąd można je wyizolować
Zalety:-są homogenne, -brak niespecyficznych p/ciał-łatwe w charakterystyce, -nie ma różnic między partiami
Znakowanie p/ciał: -aby uwidocznić miejsce wiązania się p/ciała z a/genem
-fluorochromami (w mikroskopie fluo.)
-fluoresceina (FITC)
-rodamina (TRITC)
-enzymami(mikroskop świetlny i elekt.)
-metalami (m. elekt.)
Znacznik jest przyłączony do frag. Fc p/ciała

BARWIENIE immunohistochemiczne:
-stosujemy chromogen: dla peroksydazy jest to: DAB, 4-chloro-1-paphtol
ETAPY:
1. Utrwalenie materiału-świeży
a)mrożenie-zimny aceton
b) rozmazy krwi-suszenie na powietrzu, aceton
c)cytologia -95%etanol
-zatopiony w parafinie; utrwalamy w 10% buforowanej formalinie(!!!)- 24-48h, stałe pH
2. Zatopienie materiału w parafinie
3. Krojenie na szkiełku podstawowym silanizowane (mocniej przytwierdza tkankę). tak cienko jak sie da(2-3mm)
4. Wysuszyć przez 1-2h w temp. 60`Club przez noc w temp. 37`Ciprzez 1h w temp 60`C
5. Odparafinować i uwodnić (ksylen I, II, III; alkohol absol. 96%, 70%; woda destylowana)
6. Odsłanianie miejsc antygenowych- przywraca a/genowi pierwotne cechy utrwalenie i zatopienie często powoduje zmiany w cząst. a/genu, które utrudniają rozpoznanie determinant przez p/ciało.
-kuchenka mikrofalowa
-łaźnia wodna
-szybkowar
Bufory stosowane do odkrywania: Cytrynowy ph6; Tris/EbTA ph9; TRS ph6; TRS ph9; TRS ph9,9
7. Blokowanie endogennej peroksydazy jest potrzebne, gdy enzym znacznikowy jest peroksydana (jest to enzym kat. utlenienie różnych substratów przez wodę)
Stosujemy: 0,3% wody utlenowanej w metanolu
Peroksydaza endogenna występuje w erytrocytach, granulocytach, mięśniach, monocytach
8. Inkubacja z pierwotnym p/ciałem: rodzaj, rozcieńczenie, czas, temp.
9. Zastosowane systemu detekcyjnego

Typy reakcji immunohistochemicznych
1.Met. bezpośrednia: polega na połączeniu z tkanki za znakowanym p/ciałem
Wady: stosowanie nierozcieńczonych p/ciał; przeciwciało połączone jest łącznikiem kowalencyjnych
2.Met. pośrednie
-reakcje antygenu z p/ciałem
-p/ciało wtórnie znakowane, które jest stosowane przeciwko pierwotnemu p/cialu; met. lepsza, można stosować różne rozcieńczenia przeciwciał
3. Met. PAP-peroksydaza-antyperoksydaza
Ietap-r. a/genu z pierwszym p/cialem
IIe.-przyłączenie p/ciała pośredniego
IIIe.-przyłączenie kompleksu peroksydaza-antyeroksydaza
4.Met.APAAP(fosfataza alkaliczna-antyfosfataza) jak PAP-inny kompleks; met. dobra, tkanka zawiera dużą ilość endogennej peroksydazy
5. Met. ABC (awidyna-biotyna)
W metodzi wykorzystuje się silne powinowactwo kompleksu
6. Met. B-SA(streptowidyna-biotyna)-bardziej czuła
7. Met. polimerowa-dwuetapowe barwienie, gdzie po pierwotnym p/ciele połączy sie polimer dekstranu do którego dołączone są cząst. wtórnych p/ciał oraz enzymy

Kontrola
(+) sprawdzamy czy zastosowane przez nas p/ciało swoiście związało się z antygenem. Przeprowadzamy to na tkankach w których wiemy, że na pewno znajduje się badany a/gen, tkankę taką przeprowadzamy się t. badaną. Brak r. pozytywnej świadczy o nieaktywnych p/ciałach lbo o błędach

(!!!) PRZYDATNOŚĆ
-określenie (potwierdzenie histogenazy nowotworu
-ustalenie miejsca wyjścia przerzutów nowotworu
-wykrywanie mikroprzerzutów (np. węzłach watowniczych)
-diagnostyka różnicowa nowotworów
-odróżnienie łagodny/złośliwy
-określenie złośliwości klinicznej
-prognozowanie wyników leczenia (i kwalifikacja do leczenia