1. Budowa genomu E.coli

Bakterie to organizmy bezjądrowe, gdzie cała informacja genetyczna upakowana jest w nukleoidzie oraz w wolnych odcinkach plazmidach (nie integrują się z chromosomem bakteryjnym). U BAKTERII NIE MA WYSOCE POWTARZALNYCH SEKWENCJI- JEDYNIE BEZPOŚREDNIO UNIKATOWE!

Wszystkie prokariota muszą umieścić w komórce DNA, które jest 1000 razy większe od całej komórki. Modelowym organizmem do opisu genomu bakteryjnego jest E. coli.

• Genom E. coli to dwuniciowa, kolista cząsteczka DNA o wielkości 4700000 pz.

• Brak wolnych końców 5’ i 3’

• Cząsteczka DNA jest bardzo skondensowana, czyli superzwinięta- tworzy jajowatą strukturę- nukleoid

• Upakowanie DNA jest efektem działania białek HU, HNS, SMC

• Białka HU i HNS są w genomie E. coli reprezentowane w obfitości, łączą się z DNA tworząc superzwinięte domeny ( 20000- 100000 pz). Połowa z tych domen nigdy się nie rozwija, zwinięcie to jest negatywne, czyli niezgodne z ruchem wskazówek zegara.

• Negatywne superzwoje są utrzymywane przez topoizomerazy.

• Szczególnym rodzajem topoizomeraz jest enzym gyraza, który usuwa pozytywne superzwoje, powstające podczas replikacji DNA oraz transkrypcji.

Genom bakteryjny, jako całość zorganizowany jest od 50 do 100 wielkich pętli lub domen. Wielkość domen (50000- 100000 pz). Końce tych domen łączą się z kompleksem białek błonowych tworząc macierz nukleoidową, swoiste rusztowanie dla genomu bakteryjnego.

Genom jest ujemnie zwiniętą superhelisą. Domeny mogą być niezależne od siebie pod względem położenia- mogą utrzymywać różny poziom superhelikalności.

1. W jaki sposób jest upakowane DNA w nukleoidzie bakterii

U bakterii (E. coli) występują białka histonopodobne, organizują DNA bakteryjny w odpowiednie struktury. Wyróżniamy cztery białka histonopodobne: HU, IHF, FIS, H-NS.

HU wykazuje podobieństwo do H2B. Białko to występuje, jako tetramer, wokół którego owija się DNA w liczbie 60 pz i tworzy się struktura nukleosomopodobna. Nie wiadomo, czy tetramery są rozmieszczone regularnie wzdłuż DNA. W jądrze e. coli występuje 60 tys. tego białka.

1. W jaki sposób większość wirusów wnika do komórki gospodarza

Wirusy z grupy papova są wprowadzane do komórki za pomocą endocytozy, w której uczestniczy receptor (rozpoznający wirusa jako nie obcego). Wirusy są transportowane do jądra komórkowego, gdzie uwalniają swój DNA.

Wirus mozaiki kalafiora (CaMV) wchodzi do komórki z zewnątrz przez nakłucie owadów albo przechodzi z sąsiednich komórek na skutek transportu (przez plazmodesmy). CaMV podobnie jak hepadnavirusy dokują przy porach jądrowych, tam znajdują specjalne białka dokujące i uwalniają swój DNA do jądra. Uwolniony DNA jest niekompletny i ulega „ reperacji” w jądrze i formuje superzwinięty dsDNA i tworzy mini chromosomy. Pozostałe wirusy jak wirus grypy, opryszczki wchodzą do komórki za pomocą endocytozy, ale w przypadku wirusa grypy tworzy się endosom. W endosomie jest kwaśne środowisko, które prowadzi do oddzielenia się białka M1 i fuzji wiralnej i endosomalnej błony. W endosomie w wyniku tego powstaje 8 pojedynczych rybonukleokapsydów, które są uwalniane i transportowane do jądra.

Inne wirusy jak HIV 1 uwalniają swoje kapsydy do cytoplazmy i w cytoplazmie odbywa się odwrócona transkrypcja. Po tym nukleokapsydy rozpadają się i powstają reintegracyjne kompleksy składające się z DNA oraz 3 białek: Vpr, IN oraz MA, one pomagają w dostaniu się wirusa do jądra.

Wirus opryszczki: jego kapsydy są transportowane za pomocą dyneiny (białko motoryczne), które transportuje je do jądra i tam jest uwalniany genom wirusa i łączy się z histonami i tworzą się struktury podobne do nukleosomów.

Agrobakteria zatrzymuje się w miejscach zranienia na kom roślinnych. Z tych miejsc przekazywane są sygnały, które indukują coś tam do produkcji białek wirusowych, one są zaangażowane w wycinanie z plazmidu i transportują jednoniciowy plazmid do komórki. Powstaje kompleks T-DNA….

DNA SV40 jest połączony z nukleosomami komórki gospodarza i tworzy mini chromosomy wewnątrz wirionu i w jądrze zainfekowanej komórki. Do produkcji białek obie nici są używane jako matryca, jednak jest znaczna różnica w replikacji. Jedna nić jest replikowana wcześniej w cyklu replikacyjnym wirusa i z niej syntetyzowane jest białko konieczne do replikacji wirusowego DNA. Uważa się że wczesny mRNA (19S) wirusa transkrybowany jest z wolnego rodzicielskiego DNA, co oznacza, że integracja wirusowego DNA z DNA gospodarza jest konieczna dla ekspresji wczesnego genu wirusowego. Integracja następuje w czasie pojawienia się w jądrze antygenu T, głównego produktu ekspresji wczesnego genu. Równocześnie następuje stymulacja produkcji kom RNA i rozpoczyna się replikacja kom RNA…

Późna transkrypcja daje w efekcie syntezę trzech białek. Gen SV 40 jest regulowany sekwencjami liderowymi o długości 200 p.z. o obszarze genu 16 S RNA i sekwencje wzmacniające występujące przed lub po sekwencjach, na które oddziałują. Genom SV 40 wyróżnia się:

1 – mini chromosomy

2 – podział na wczesną i późną transkrypcję

3 – sekwencje liderowe

4 – sekwencje wzmacniające

Transkrypcja wczesnego wirusowego mRNA stanowi 0,01% całkowitej syntezy mRNA w kom i ma stałą sedymentacji 26S. Jest na końcu 5’ zaopatrzony w czapeczkę guaninową i jest poliadenilowany (poly-A) na końcu 3’. Jest on przerobiony na 3 rodzaje mRNA 19S. W efekcie późnej transkrypcji powstają dwie klasy mRNA: 16S i 19S

1. Plan replikacji wirusowej RNA po zakażeniu komórki

a) Wirus przyłącza się do komórki

b) Wnika do jej wnętrza

c) Podłaszcza się, tzn. traci otoczkę białkową

d) DNA jest przepisywane na różnorodne mRNA kodujące albo 5’ wczesne albo późne białka. Oba typy białek są syntetyzowane na rybosomach komórkowych. Białka wczesne mogą być…

Wszystkie wirusy mają na swojej powierzchni białko, które ma miejsce wiążące receptor znajdujący się na powierzchni komórki.

Po przyłączeniu się do komórki następuje fuzja otoczki wirusa z błoną plazmatyczną komórki i uwolnienie kwasu nukleinowego wirusa. Wirusy mają specjalne białko fuzyjne pośredniczące w zlewaniu się lipidów osłonki wirusa i błony komórkowej.

Na drodze pinocytozy – wiropeksji wnika cały winion do wnętrza komórki. W tym pośredniczy białko klatryna, która otacza wirus i w pęcherzykach wnika do komórki. Uwolnienie wirusa z otoczki następuje przy pomocy białka wirusowego hemaglutyniny (HA). Po uwolnieniu wirus migruje do jądra komórkowego i tam ulega transkrypcji i replikacji. Nie wiadomo jak jest zabezpieczany kwas nukleinowy wirusa w cytoplazmie przed nukleazami.

1. Budowa operonu laktozowego

OPERON LAC- przykład budowy genów kodujących mRNA u bakterii

3 geny strukturalne lacZ, lacY, LacA. LacZ koduje B-galaktozydazę, enzym, który tnie laktozę na galaktozę i glukozę, które są źródłem energii dla bakterii.

• LacY koduje permeazę laktozową, białko błonowe systemu transportu laktozy i B- galaktozydazy do komórki.

• LacA koduje transacetylazę, która oczyszcza komórkę z toksycznych tiogalaktozydów pobranych przez permeazę.

• W górę od tych genów jest gen regulatorowy, kodujący rep resor Lac. Jest on stale aktywny pod kontrolą własnego promotora.

W braku laktozy represor Lac w formie tetrameru łączy się z sekwencjami operatora które zachodzą na obszar promotora. Z tego względu represjo Lac blokuje przyłączanie się polimerazy RNA do promotora i transkrypcja operonu lac jest represjonowana. W obecności laktozy operon lac jest indukowany. Prawdziwym indykatorem jest alternatywna forma laktozy zwana allolaktozą.

Kiedy bet- galaktozydaza tnie laktozę do glukozy i galaktozy, mała frakcja laktozy przemienia się w allolaktozą. W czasie przyłączenia allolaktozą, represor lac podlega zmianie allosterycznej w domenie łączenia się z operatorem, obniża jej powinowactwo łączenia się z DNA do poziomu niespecyficznego, uwalniając od represji lac. Oprócz tego jest także aktywacja transkrypcji. W miejscu odległym od operonu lac jest gen kodujący kataboliczny aktywator białkowy Cap. Jest on receptorem cAMP stąd też często nazywa się go białkiem CRP. CAP łączy się do DNA wewnątrz operonu w miejscu zwanym CAP. To białko tworzy kompleks Cap- polimeraz RNA- DNA i jest przykładem kooperacyjnego łączenia się białek z DNA.

Transkrypcja zaczyna się wtedy, gdy jest wyczerpana glukoza w podłożu, gdyż ona obniża syntezę cAMP, które jest potrzebne do aktywacji CAP, aby mogło połączyć się z DNA.

Bez wspólnego połączenia CAP z polimerazą RNA transkrybuje geny operonu lac na bardzo niskim poziomie zwanym poziomem podstawowym, który jest ok. 40 razy niższy od aktywowanej transkrypcji.

Operon lac E. coli zawiera wewnętrzne terminatory transkrypcji zależne od Rho i białko to kończy transkrypcję w przypadku niedoboru aminokwasów w komórce. Wewnątrzgenowe terminatory nie funkcjonują w warunkach normalnej ekspresji, dlatego, że przeszkadza im obecność rybosomów, które prowadzą translację równocześnie niemal z transkrypcją. Jednak, kiedy jest brak aminokwasów biosynteza białek zostaje zahamowana, a wtedy zostaje eksponowana sekwencja rut na transkrypcie i przyłącza się tam białko Rho i kończy transkrypcję. Dla komórki jest to energetycznie korzystne gdyż zapobiega wydatkowi energii na transkrypt, który nie będzie ulegał translacji.

OPERON LAC

• Inicjacja transkrypcji odbywa się z miejsca -35 i -10 nukleotydów w obszarze promotora. Sekwencja zgodna do -35 jest TTGACA, a dla miejsca -10- TATAAT ( znana jako Pribnow box)Te miejsca są rozpoznawane przez polimerazę RNA i do nich sona się przyłącza.

• Aktywność Pol RNA w danym promotorze zależy od interakcji z białkami regulatorowymi- czynnikami transkrypcyjnymi. Mogą one być aktywatorami lub rep resorami. Dostępność promotora dla maszynerii transkrypcyjnej jest regulowane w większości przez sekwencje aminokwasowe w białkach zwane operatorami. W większości operonów operator wiąże represor ale są też obszary DNA, w których sekwencje rep resorowe i aktywatorowe zachodzą na siebie.

• Przykładem regulacji za pomocą katabolitu jest operon laktozowy, odpowiedzialny za otrzymywanie energii z beta- galaktozy w postaci laktozy.

• W operonie laktozowym w obszarze regulatorowym leży gen i- regulatorowy, który koduje białko represorowe, występuje 3 geny strukturalne Z, Y i A, gen Z koduje hydrolazę b- galaktozydazę, która hydrolizuje laktozę na monosacharydowe jednostki- glukoza i galaktoza. Gen Y koduje enzym permeazę, która zwiększa przepuszczalność błony komórkowej dla b- galaktozydów, a gen A koduje transacetylazę.

• Kiedy bakteria rośnie na pożywce z glukozą, represor lac jest połączony z obszarem operatora i zapobiega transkrypcji- blokuje miejsce polimerazie RNA.

• Jeżeli w pożywce pojawia się induktor, np. laktoza. Represor łączy się z nim i dalej już nie może być przyłączonym do operatora w obszarze promotora. Wtedy polimeraza RNA może się połączyć w promotorze i transkrypcja może się zacząć.

• Może następować tez represja operonu lac nawet w obecności laktozy, jeżeli jest tez obecna glukoza. Jest ona utrzymywana Az do wyczerpania się glukozy. Ten rodzaj represji jest nazywany represja kataboliczną i wynika z niskich poziomów cAMP. Represja lac operonu jest łagodzona w obecności glukozy i z nadmiarem cAMP, kiedy poziom glukozy w pożywce spada to wzrasta poziom cAMP.

• Aktywacja operonu przez cAM wynika interakcji cAMP z białkiem CRP. Jest ono też nazywane białkiem CAP. Kompleks cAMP- CRP łączy się do obszaru w górę obszaru łączenia się polimerazy RNA i częściowo zachodzi na miejsce łączenia się represora w obszarze operatora. To połączenie aktywuje Pol RNA od 20 do 50krotnie.

1. Opisać punkt startu replikacji DNA u bakterii

U E. coli

Do elementów o 9 pz i do jednego o 13 pz przyłącza się DnaA z ATP w liczbie ok. 30 cząsteczek. Jest ono wspomagane przez białko HU strukturalne chromatyny bakteryjnej. Białka te wpływają w sposób fizyczny na DNA, w miejscu, do którego się przyłączają. Pod wpływem napięcia powodowanego przez te białka następuje rozdzielenie DNA na obszarze 20 pz i powstaje bąbel- oczko replikacyjne.

Do tak powstałego oczka przyłączają się białka DnaB-DnaC i powstaje kompleks preinicjacyjny. DnaC jest przenośnikiem dla DnaB i po przyłączeniu DnaB jest uwalniane.

Białko DnaB jest helikazą, która otwiera dwuniciowy DNS i umożliwia przyłączenie się enzymów replikacyjnych.

DnaB- helikazą DNA i helikazowy ładowacz- DnaC są obecne w 6 kopiach. Helikaza DNA jest utrzymywana w nieaktywnym stanie w kompleksie DnaB- DnaC. Po przyłączeniu się do ssDNA helikazowy ładowacz kieruje przyłączenie helikazy DnaB wokół ssDNA, podobnie jak ślizgająca się klamra DNA wokół połączenia: starter- wzorzec.

Załadowana helikaza przyciąga primazę(polimeraza RNA) i następuje synteza RNA startowego na każdej nici ori.

Następnie jest przyciągana polimeraza III- holoenzym poprzez primer- wzorzec połączenie i przez helikazę. Kiedy jest już przyłączona PoIII razem z nią jest załadowana klamra ślizgowa na starterze RNA.

1. Jak zachowują się polimerazy DNA na widełkach replikacyjnych u bakterii w porównaniu do eucaryota

1. U bakterii dwie polimerazy III replikują razem, jako dimer

2. U eukariontów nie ma struktury dimerowej a polimerazy sigma i eta replikują oddzielnie nić wiodącą i opóźnioną. Nad tym czuwa kompleks białkowy- czynnik replikacyjny C, który kontroluje odłączanie się i włączanie się enzymu na nici opóźnionej.

3. W kom. eukariotycznych nie ma replisomu. Są natomiast liczne kompleksy białkowe replikacyjne na stałe związane z macierzą jądrową tworzące tzw. fabryki replikacyjne.

4. Eukariotyczna polimeraza alfa zawiera aktywność prymazową i może budować startery na początku nici wiodącej jak i na początku fragmentów Okazaki.

5. Usuwanie starterowego RNA odbywa się za pomocą endonukleaz FEM1, a u bakterii czyni to polimeraza z aktywnością egzonukleazy 5’ > 3’

6. U eukariotów nie ma sekwencji DNA kończących replikację DNA.

1. Zakończenie replikacji DNA u bakterii

Sekwencje DNA terminatorowe u E. coli- jest ich 7. Do nich przyłącza się białko, Tus, które pozwala na przejście widełek replikacyjnych tylko w jednym kierunku, a zatrzymuje przejście widełek w kierunku przeciwnym. Zatrzymuje działanie helikazy odpowiadającej za ruch widełek.

Po replikacji kolistej cząsteczki DNA, potomna cząsteczka jest połączona ze starą- ogniwem- katenanem. Rozdzielenie tych cząsteczek odbywa się za pomocą topoizomerazy II. Aby cząsteczki mogły segregować topoizomeraza rozłącza je.

Cząsteczka liniowa kończy replikację na nici opóźnionej w ten sposób, że dla ostatniego fragmentu Okazaki używa, jako startera białko z grupą –OH przy C5’. Takie białko występuje w liniowych chromosomach niektórych wirusów i bakterii zwierzęcych.

1. Jak jest zbudowana bakteryjna polimeraza RNA

POLIMERAZA U E. COLI

• Główną polimerazą jest polimeraza III, jest ona częścią większego kompleksu- holoenzym. Holoenzym składa się z 10 różnych podjednostek, z których podjednostka alfa ma aktywność replik azową a eta ma zdolność sprawdzania- egzonukleazową 3’- 5’.

• Oba enzymy Pol. III i I DNA mają miejsce sprawdzania dokładności włączania nukleotydów. Pozostałe trzy polimerazy są zaangażowane w naprawianie DNA i nie mają właściwości korekcyjnych.

• Pol I DNA u bakterii ma za zadanie usuwanie starterowego RNA, ma aktywność nukleazową. Nie jest wysoce procesywna, ale usuwa połączenie RNA- DNA, które jest oporne na działanie RNAzyH. Syntetyzuje krótkie odcinki DNA wypełniające miejsca wycięcia RNA- DNA. Ma dwie podjednostki: fragment Klenowa z aktywnością 5’ > 3’ i druga podjednostka ma aktywność 5’ >3’ i 3’ > 5’.

• Pol II zaangażowana głównie w mechanizmy naprawy DNA. Polimerazy IV i V pośredniczą w syntezie DNA wypełniające miejsca uszkodzone w DNA. Obie polimerazy tworzą bypass uszkodzonego miejsca DNA, które blokuje replikacje DNA przez polimerazę II. Obie polimerazy odgrywają rolę w adaptacyjnej mutagenezie i są skłonne do błędnego włączania nukleotydów w czasie naprawy.

1. Co to są plazmdy

PLAZMIDY (WYSTĘPUJĄ U WSZYSTKICH BAKTERII!!!)

• Forma dwuniciowego DNA

• Stanowi od 0, 1 do 5% ilości całego DNA w nukleoidzie, występuje w cytoplazmie bakteryjnej

• Wielkość plazmidu waha się od 2 000 do 100 000 pz.

• Wyróżnia się także rzadziej spotykane plazmidy liniowe

• Plazmidy są autonomiczne- same replikują swoje DNA, w czasie podziału komórkowego jedna kopia informacji zawartej w plazmidzie trafia do komórki potomnej

• Plazmidy mają wiele genów posiadających odporność na antybiotyki, stąd stanowią nośniki w technologii

• Plazmidy w stosunku do komórki gospodarza mogą mieć charakter pasożytniczy lub symbiotyczny

• Oprócz plazmidów w komórce bakteryjnej występują episomy. Są one również autonomiczne, jednakże mogą integrować z bakteryjnym chromosomem. Przykładem episomu jest czynnik F, który kontroluje koniugację bakterii oraz wymianę pomiędzy nimi genów.