3. Podstawowe pojęcia i terminy
Transfekcja – wprowadzenie fragmentu DNA do komórki eukariotycznej
Komórki Jurkat – unieśmiertelnione limfocyty T
DNA plazmidowy – kwas dezoksyrybonukleinowy obecny poza chromosomem bakterii, najczęściej kolisty, używany w biologii molekularnej do transferu materiału genetycznego
Gen – sekwencja DNA kodująca białko lub RNA
Elektroporacja – metoda wprowadzania materiału genetycznego do komórek opierająca się na tworzenie przerw w błonie komórkowej przy pomocy pola elektromagnetycznego
Pożywka hodowlana – roztwór związków odżywczych używany do hodowli komórek
PMA oraz PHA-L - związki chemiczne aktywujące ekspresję genetyczną
5. Przebieg postępowania
5.1. Komórki przenosi się do nowej pożywki na 24 godziny przed elektroporacją.
5.2. W dniu elektroporacji komórki przygotowuje się wg instrukcji I/14/01/01
5.3. Należy przenieść 200 µl przygotowanych komórek Jurkat do kuwety elektroporacyjnej o drodze optycznej 2 mm.
5.4. Do kuwety dodaje się 8 µl plazmidowego DNA o stężeniu 1 µg/µl.
5.5. Kuwetę umieszcza się w porcie do elektroporacji i wybiera się protokół „Jurkat” z menu aparatu.
5.6. Do kuwety dodaje się 0,5 ml pożywki hodowlanej, następnie należy przenieść zawartość kuwety na płytkę hodowlaną.
5.7. Po 4 godzinach dodaje się po 10 µl związków aktywujących PMA oraz PHA-L .
5.8. Po 48 godzinach sprawdza się ekspresję przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.
5.9. Sporządza się raport z przeprowadzonej analizy. Należy policzyć komórki które przyjęły gen przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.
6. Punkty krytyczne
5.2. Właściwie przygotowanie komórek do elektroporacji jest niezbędne do uzyskania satysfakcjonującego poziomu ekspresji. W przypadku błędu należy niezwłocznie powtórzyć punkt.
5.6. Sprawne wykonanie etapu pozwala na uzyskanie wystarczającej przeżywalności komórek. Błąd na tym etapie wymaga powtórzenia całej procedury od początku.
8. Zapisy
Raport z badania wykonuje się na podstawie obserwacji mikroskopowych. Należy zliczyć komórki wykazujące ekspresję danego genu po elektroporacji, a także ogólną liczbę komórek w polu widzenia mikroskopu. Należy określić procent ekspresji wprowadzonego genu na podstawie zapisanych danych.
9. Załączniki
Formularz raportu z badania
10. Spis materiałów chemicznych i sprzętu.
Pożywka hodowlana RPMI 1640
Pożywka do transfekcji Opti-MEM
Bufor PBS
Plazmidowy DNA
Kuwety do elektroporacji
Mikroskop fluorescencyjny
Aparat do elektroporacji
Pipety
Probówki plastikowe
Płytki hodowlane
ELEKTROPORACJA KOMÓREK JURKAT – RAPORT Z BADANIA
| Data analizy | |
|---|---|
| Podpis operatora | |
| Ilość komórek które przyjęły gen | |
| Ilość komórek | |
| Procent ekspresji |
PRZYGOTOWANIE KOMÓREK JURKAT DO ELEKTROPORACJI I/14/01/01
0,5 ml hodowli komórkowej Jurkat liczy się przy pomocy hemocytometru Thoma
Przeprowadza się wirowanie przy 400 rcf przez 7 minut odpowiedniej ilości hodowli zawierającej 5 x 106 komórek.
Osad zawiesza się w 5 ml roztworu PBS i powtarza wirowanie.
Otrzymany osad zawiesza się w 1 ml pożywki Opti-MEM.
Instrukcję opracował: Mateusz Sturgulewski
Instrukcję zatwierdził: Dominika Piasecka
Instrukcję stosuje się w procedurze PJ/14/01/01