Podłoże mikrobiologiczne – środowisko zapewniające optymalne warunki do rozwoju mikroorganizmów. Musi być ono jałowe, przejrzyste i zawierać odpowiednie składniki – źródło węgla, azotu, energii (z reguły źródłem energii w podłożu jest węgiel).
Podłoże mikrobiologiczne musi być także wyposażone w odpowiednie pH, ciśnienie osmotyczne oraz potencjał redox.

Podział podłoży mikrobiologicznych:
a) stan skupienia:
- płynne – namnażanie bakterii,
- półpłynne – obserwacja ruchów bakterii + określanie cech biochemicznych,
- stałe – zwykle w formie tzw. ‘skosu’, stosowane w celu przechowywania bakterii.
b) zawartość składników odżywczych:
- minimalne (zawierają jedno źródło węgla, pochodzące głównie z rozkładu węglowodanów, np. podłoże M9 – z ropą naftową),
- pełne (wiele źródeł węgla, np. bulion odżywczy),
- wzbogacone (stosowane z reguły do posiewu bakterii chorobotwórczych; wzbogacone o krew, mleko, żółtko jaja, itp.).
c) pochodzenie:
- naturalne (np. bulion),
- półsyntetyczne (większość składników podłoża jest znanych, lecz nie wszystkie),
- syntetyczne (o konkretnie określonym składzie).
d) zastosowanie:
- z dodatkiem czynnika selekcyjnego (np. podłoże z antybiotykiem, metalem ciężkim, itp.),
- podłoże do namnażania,
- wybiórcze (podłoże, w przypadku którego składniki powodują wzrost jednej grupy mikroorganizmów, hamując jednocześnie rozwój drugiej; z reguły są to podłoża stałe),
- namnażająco-wybiórcze (hamowanie namnażania jednej biomasy, namnażanie drugiej),
- identyfikacyjne (wykrywanie konkretnego gatunku mikroorganizmów).

Agar – policukier, otrzymywany z glonów. Posiada gęstszą konsystencję niż żelatyna i ulega topnieniu w temp. powyżej . Jest rozkładany przez nieliczne bakterie; jego skuteczniejszość jest więc większa niż żelatyny.

Żelatyna – białko, będące hydrolizatem kolagenu, pozyskiwane z wieprzowiny.

Dezynfekcja – zabijanie tylko form przetrwalnikowych.
Sterylizacja – zabijanie form wegetatywnych i przetrwalnikowych mikroorganizmów.
Pasteryzacja – rodzaj sterylizacji, w którym przyjmowaną temperaturą jest 60- (WYJĄTEK! – pasteryzacja UHT – ciecz poddawana jest wysokiej temperaturze tylko na kilka sekund).

Laminar – stanowisko pracy mikrobiologa, oddzielone od środowiska szybą, wyposażone w światło UV oraz przepływ sterylnego powietrza.

Autoklaw – urządzenie, służące sterylizacji pożywek o składnikach odpornych na wysokie temperatury. Sterylizacja możliwa jest dzięki gorącemu () sprężonemu powietrzu.

Suszarki – urządzenia, służące do sterylizacji szkła. Sterylizacja w wysokiej temperaturze (140-).

Aparat Kocha – służy do sterylizacji podłoży. Jest to wielki kocioł, z podwójnym dnem. W dolnym rejonie kotła znajduje się gorąca woda, która przechodząc w parę wodną (temp. Ok ), unosi się w wyższe rejony kotła i sterylizuje podłoża. Jest to metoda sterylizacji, w przypadku której formy przetrwalnikowe i niektóre wirusy nie ulegają degradacji.

Sterylizacja przez filtrację – rodzaj sterylizacji, w przypadku którego używany jest specjalny zestaw filtrujący (lejek, kolba, pompka wytwarzająca podciśnienie, itp.). Wielkość porów w lejku zależy od filtrowanego materiału: 0,22 mikrometrów – dla bakterii, 0,45 mikrometrów – dla wirusów.






Sterylizacja promienieniami UV – ta metoda sterylizacji używana jest głównie do wyjaławiania pomieszczeń. Zakres długości fali świetlnych: 230 – 270 nanometrów (długość fali zabójcza dla bakterii: 260 nm).
Traktowanie bakterii falą o długości 260 nm powoduje tworzenie dimerów:
a) tyminy – DNA staje się niestabilne, co prowadzi do śmierci bakterii,
b) cytozyny – efekt mutagenny.

TYNDALIZACJA – 3-krotna sterylizacja podłoża (powodowanie kiełkowania form przetrwalnikowych, a następnie sterylizacja. Czynności te przeprowadza się 3 razy).

DEKOKTACJA – sterylizacja przez gotowanie.

WYŻARZANIE – opalanie sprzętu laboratoryjnego (ezów).

FOTOREAKTYWACJA – naprawda DNA u bakterii. Polega ona na rozszczepianiu dimerów przez odpowiedni enzym (fotoliazę).

Sanityzacja – działania, zapobiegające zakażeniom oraz ograniczające rozwój bakterii (traktowanie detergentami, środkami chemicznymi).

Aseptyka - postępowanie mające na celu dążenie do jałowości pomieszczeń, narzędzi, materiałów opatrunkowych i innych przedmiotów w celu niedopuszczenia drobnoustrojów do określonego środowiska, np. otwartej rany.

Antyseptyka - postępowanie odkażające, mające na celu niszczenie drobnoustrojów na skórze, błonach śluzowych, w zakażonych ranach. W przeciwieństwie do dezynfekcji, antyseptyka nie dotyczy odkażania przedmiotów.





ĆWICZENIE 2

Rodzaje mikroskopów:
a) Mikroskop akustyczny - przyrząd wykorzystujący fale ultradźwiękowe (o częst. do kilku GHz) do otrzymywania powiększonego obrazu elementów struktury ośrodka sprężystego,
b) Mikroskop elektronowy zbudowano według idei mikroskopu optycznego ale w miejsce promieni świetlnych używa się wiązki elektronów,
c) Mikroskop fluorescencyjny to mikroskop świetlny używany w badaniach substancji organicznych i nieorganicznych, którego działanie oparte jest na zjawisku fluorescencji i fosforescencji, zamiast, lub razem ze zjawiskami odbicia i absorpcji światła (co jest wykorzystane w klasycznym mikroskopie optycznym). Pozwala na wyznakowanie interesujących elementów komórki (np. białek, czy organelli), fluoforami o zadanych właściwościach (np. barwie emisji),
d) Mikroskop holograficzny to mikroskop pozwalający uzyskać bardzo dużą głębię ostrości i szybką rejestrację obrazów 3D, dzięki pomiarowi natężenia i fazy promieniowania rozproszonego przez obiekt. W m.h. soczewkowym najpierw otrzymuje się zarejestrowany na płycie fot. obraz interferencyjny, a następnie, po jego wywołaniu, odtwarza z niego holograficzny obraz pozorny obserwowany za pomocą okularu,
e) Mikroskopia jonowa - bardziej poprawnie zwana mikroskopią pola jonowego Field ion microscopy (FIM) to technika analityczna stosowana w nauce o materiałach. Za pomocą tej techniki można oglądać atomy na powierzchni specjalnie spreparowanych, gładkich i twardych metalowych odkuwek,
f) Mikroskop konfokalny – nowoczesna odmiana mikroskopu świetlnego, w którym źródłem światła jest laser. Mikroskop ten umożliwia dokonywanie tzw przekrojów optycznych preparatu, analizuje bowiem światło pochodzące z jednej jego płaszczyzny, eliminując światło docierające z warstw położonych wyżej lub niżej,
g) Mikroskop optyczny to urządzenie do silnego powiększania obrazu, wykorzystujące do generowania tego obrazu światło przechodzące przez specjalny układ optyczny składający się zazwyczaj z zestawu kilku-kilkunastu soczewek optycznych. Mikroskop optyczny może wykorzystywać zwykłe światło dzienne, dostarczane do układu optycznego przez specjalne lusterko, lub wykorzystywać sztuczne światło, którego źródło znajduje się zazwyczaj pod analizowaną próbką.  Mikroskop optyczny używany do badań obiektów anizotropowych w świetle spolaryzowanym. Stosowany jest m.in. do badania: kruszców, minerałów, preparatów biologicznych, struktury komórek i tkanek, w matalografii, w przemyśle szklarskim i włókienniczym,


h) Mikroskop stereoskopowy (binokular) - mikroskop optyczny z oddzielną optyką dla obu oczu pozwalający na przestrzenne widzenie obrazu powiększanego.

Budowa mikroskopu optycznego:



Zdolność rozdzielcza mikroskopu – najmniejsza odległość między dwoma punktami, które dostrzegalne są jeszcze oddzielnie.
Zastosowanie olejku immersyjnego powoduje zwiększenie zdolności rozdzielczej mikroskopu.
Wzór:
d = 2A/ lambda A – apertura numeryczna, lambda – dł.fali świetlnej.


Barwienie mikroorganizmów:
- barwienie proste – barwienie preparatu tylko jednym barwnikiem przez 1-2 minut, np. barwienie drożdży fioletem metylenowym,
- barwienie złożone – barwienie preparatu kilkoma barwnikami wg ściśle określonej kolejności lub znajdujących się w mieszaninie. (Barwienie metodą Gramma, Neissera, Ziehl-Neelsena),
- barwienie pozytywne – polega na zabarwieniu w preparacie komórek (dobrze wybarwiony obiekt na jasnym tle),
- barwienie negatywne – uniewidocznienie otoczenia (tło wybarwione, natomiast komórki jasne, niewybarwione). Metoda stosowana przede wszystkim do barwienia krętków i otoczek bakterii,
- barwienie przyżyciowe – działanie na nieutrwalony preparat żywych drobnoustrojów barwnikiem w dużym rozcieńczeniu, nie niszcząc komórek.

- barwienie utrwalone – barwienie nieżyjących drobnoustrojów, prowadzące do uszkodzenia komórek.

Barwniki – związki chem., zdolne do adsorbowania się na lub rozpuszczania się w barwionych substancjach, dając trwałe, barwne połączenia. W cząst. Tych związków wyróżniamy grupę chromoformową (barwną, grupy azo-, nitrozo-, azoksy-, itp.). i grupę auksochromową, zdolną do tworzenia soli z barwionym substratem.

Rodzaje barwników:
- kwaśne – często używane do barwienia tła preparatu, np. eozyna, fuksyna kwaśna, nigrozyna,
- zasadowe – najczęściej stosowane w roztworach alkoholowych lub wodnych, np. błękit metylenowy, fiolet krystaliczny, fiolet goryczkowy, fuksyna zasadowa.

BARWIENIE METODĄ GRAMA:
- zastosowanie: podział bakterii na Gram-dodatnie i Gram-ujemne,
- wykonanie rozmazu zawiesiny drobnoustrojów,
- utrwalenie w płomieniu palnika,
- barwienie: (wszystkie etapy barwienia przedziela się przemywaniem preparatu wodą)
a) r-r fioletu krystalicznego (2-3 min),
b) utrwalenie płynem Lugola (1,5-2 min),
c) odbarwienie etanolem (z dodatkiem acetonu, 30 sek.),
d) odbarwienie barwnikiem kontrastowym (np. safranina, 20 sek).
Drobnoustroje barwiące się na fioletowo są określane jako Gram-dodatnie, Gram-ujemne to natomiast te, które barwią się na różowy(czerwony)

BUDOWA ŚCIAN KOMÓRKOWYCH

Gram +	Gram -
- zbudowana z wielu warstw peptydoglukanu, który odwodniony etanolem zostaje uszczelniony, - alkohol powoduje wytrącanie się szkieletu cukrowego oraz denaturację peptydów, - efektem tego jest trwałe zamknięcie porów między warstwami mureiny i zatrzymanie barwnika w komórce. -barwią się na fioletowo (brązowe – dobarwiane)	- 1-3 warstw peptydoglukanu, (mureiny) - potraktowanie alkoholem tak cienkiej warstwy nie jest wystarczające by zamknąć pory komórkowe, -Ściana kom. jest cieńsza, zawiera mniej peptydoglikanu - barwnik więc zostaje wymywany, a komórka przybiera kolor różowy.