konformacje białek

Wykład 1

Białka 15-18% całkowitej masy komórki . W komórce panuje ogromny tłok makrocząsteczkowy (ang. macromolecular crowding) 20-30% objętości komórek jest zajmowane przez makrocząsteczki (200-300 g/l).

Struktury białek: domeny, fałdowanie

Struktura i funkcja wybranych białek (fibrylarne np. kolagen, keratyna, jedwab)

Białka klejące; białka motory np. miozyna , synteza ATP, dyneima

Białka opiekuńcze (chaperony)

Choroby związane z nieprawidłową strukturą i agregacją białek tzw. choroby konformacyjne/agregacyjne

Amyloidozy (zewnętrzne agregaty) zaćma, miopatie, mukowiscydoza, neurodegeneracyjne.

Budowa białka – zbudowane z aminokwsów

Aminokwasy zbudowane z łańcucha bocznego, grupa aminowej, gr. karboksylowej przyłączonych do atomu węgla zwanego węglem alfa. Wszystkie aminokwasy (z wyjątkiem glicyny = najprostszy aminokwas) należą do związków optycznie czynnych, czyli takich posiadających atom chiralny w swojej strukturze (atom chiralny musi posiadać cztery różne podstawniki) W przyrodzie białka zbudowane są tylko z L aminokwasów, aminokwasy D występują b. rzadko (np. w ścianach bakterii i Archea). Łańcuch boczny aminokwasu decyduje o jego charakterze. Kolejne aminokwasy w łańcuchu peptydowym połączone są wiązaniem peptydowym.

Możemy wyróżnić (poczytać przypomnieć sobie które to są!):

Aminokwasy niepolarne (alimfatyczne łańcuchy boczne)
Aromatyczne łańcuchy boczne,
polarne oraz zasadowe
boczne łańcuchy z grupami karboksylowymi lub aminowymi

Wiązanie peptydowe

Decyduje o budowie przestrzennej. Jest płaskie i sztywne, ponieważ dodatkowe para elektronów w wiązaniu C’=O , może uczestniczyć również w wiązaniu C’-N. Rotacja wokół wiązanai C’-N jest niemożliwa (?). Wielkość łańcuchów bocznych tzw. zawada przestrzenna.

Możliwa jest rotacja wokół wiązania C_α-C (kąt torsyjny psi ψ) oraz N-C_α (kąt torsyjny fi φ).

Ze względu na zawady przestrzenne kąty mogą przyjmować tylko określone wartości (glicyna praktycznie bez ograniczeń dzięki wielkości swoje w lewo i prawo) wykres Ramachandana (ustalił kąty) 3 obszary alfa, beta i L

Hydrofobowy rdzeń białka zawiera niepolarne reszty aminokwasowe, a na wierzchu reszty hydrofilowe.

Struktura białka stabilizowana jest przez:

wiązania wodorowe O=C N-H
wiązania jonowe
oddziaływania van der Walsa,
oddziaływania hydrofobowe
mostki S-S

Trzy poziomy struktury białek

I rzędowa: poziom aminokwasów (ich sekwencja)

II rzędowa: fragmenty łańcucha są poskręcane względem siebie (helisy α, harmonijka β(kartka))

III rzędowa: całość już pozwijana; jak cały łańcuch polipeptyd jest ułożony w przestrzeni

IV rzędowa: więcej niż jeden peptyd w układzie przestrzennym

Strukturę II rzędu zaproponowali w 1951 Linus Pauling i Robert Corey

Helisa α: wiązanie wodorowe pomiędzy N i O atomami łańcucha głównego należącymi do n i n+4 reszty aminokwasowej (co czwarta reszta tworzy wiązanie wodorowe), łańcuchy boczne znajdują się na zewnątrz, większość helis jest prawoskrętna. Pierwszym białkiem o udowodnionej strukturze helisy alfa była – MIOGLOBINA z kaszalota (John Kendrew 1958r.)

Harmonijka β (arkusz β; kartka β) wiązanie wodorowe powstają pomiędzy różnymi fragmentami łańcucha aminokwasów. Harmonijki występują w wersji równoległej (wszystkie końce aminowe z jednej strony a karboksylowe z drugiej) i anty-równoległej (na jednej stronie występują zarówno końce aminowe i karboksylowe - naprzemiennie)

Motywy - helisy i harmonijki połączone są pętlami (ang. loop)

helisa-zwrot-helisa motyw wiążący DNA
erabutoksyna dwa motywy szpili do włosów (jad węża)
motyw klucza greckiego – nukleaza Staphyloccocus (2xszpilka do włosów jeszcze zagięta względem siebie)

Pętle które łącza dwie anty-równoległe kartki β tworzą struktury zwane szpilkami do włosów lub zwrotów beta jednostka beta-beta)

Domeny są to połączenia wielu motywów w jedną całość

np. Białka uczestniczące w koagulacji i fibrynolizie, łańcuchy polipeptydowe zorganizowane w domeny podobne do EGF (czynnik wzrostu naskórka)

Wyróżniamy

domeny alfa,
domeny beta,
domeny mieszane

Superhelisa (coiled-coil) dwie helikalnie zwinięte (lewoskrętnie) helisy α, podstawa struktura większości fibrylarnych białek. (białka włókniste)

Pojawiająca się regularnie leucyna stabilizuje superhelise (oddziaływania hydrofobowe pomiędzy dwoma leucynami w pozycji d- jeśli podzielmy po 7 aminokwasów to lecyna w pozycji D często w pozycji inny aminokwas hydrofobowy)

Domenę alfa najczęściej tworzy wiązka 4 helis α stabilizacja przez wiązania hydrofobowe

Helisy alfa mogą tworzyć duże struktury

3,5 reszty aa na jeden skręt superhelisy powtarzające się siedmio-aa fragmenty a-g

reszty a i d hydrofobowe

reszty d Leu lub Ile

reszty e i g często posiadają ładunek

Strukturę superhelisy stabilizują także oddziaływania jonowe pomiędzy resztami g i e.

Bakteryjna muramidaza (lizozym) – przykład dużej domeny α

Domeny mieszane

Beczułka alfa/beta (TIM barrel) - izomeraza triozofosforanowa

Pofałdowanie OB (OB fold) zbudowane z arkuszów β i helisy α wiązanie o charakterze oligonukleotydu/ologosacharudu (nukleaza Staphyloccocus)

Helisy beta: kiedy łańcuchy β układają się w formie spirali (np. białko ogonka faga P22) Jedne skręt helisy tworzą 2 lub 3 fragmenty harmonijki.

Struktury IV rzędowe najładniejsze występują w otoczkach wirusowych bardzo złożona struktura wirus krzaczastej karłowatości pomidora

Aby białka mogły funkcjonować – muszą uzyskać ściśle określoną strukturę trójwymiarowa już nieaktualne.

Białka mogą posiadać fragmenty łańcucha polipeptydowego o nieporządkowanej strukturze

BIAŁKA INHERENTNIE (NATYWNIE) NIEPORZĄDKOWANE

Białka prawidłowo funkcjonalne mogą posiadać fragmenty o różnej długości, które nie mają uporządkowanej struktury

40% ludzkich białek posiada przynajmniej jeden lub więcej fragmentów o nieporządkowanej strukturze (ok 30 aa)

prawdopodobnie 25% białek ludzkich jest całkowicie nieporządkowany

Tradycyjny model klucza i zamka wydaje się w obliczu nowych badań nieaktualny.

Fałdowanie nieuporządkowanego fragmentu białka dopiero w trakcie wiązania innego białka np. białko CREB (ligandu białka Białko zmienia strukturę dopiero po oddziaływaniu z ligandem <Nature 2011>

Białki Sic1 po związaniu liganda pozostaje nieuporządkowane i może przyjmować różne konformacje

Posiada ono 6 różnych kieszeni fosforanowych, z którymi może wiązać się ligand, każda wiąże się po kolei – zmiany konformacji Hamuje replikacje DNA u Eukariota.

ZALETY BIN

- lepsze dopasowanie do cząsteczki z którą oddziałuje białko np. białko KREP

- oddziaływanie z różnymi białkami/ligandami

SUPRESOR genów nowotworzenia p53 przykład wielofunkcyjnego białka, które dzięki nieuporządkowanych fragmentom może oddziaływać z setkami innych cząsteczek

p53 oddziałuje zarówno z DNA i innymi białkami

Wykład 2

Białka włókniste, klejące i motoryczne – struktura i funkcje

KOLAGEN

Kolagen z gr. kólla – klej (składnik tkanki łącznej przekształcający się w żelatynę podczas gotowania)

27 (I-XXVII) typów kolagenu u ssaków, białka tworzące włókna w macierzy poza komórkowej (chrząstka rogówka, kości itd.(…)

~30% całkowitej masy białek

Odpowiedzialny za utrzymanie prawidłowej struktury tkanek, adhezje, kohezje i chemotaksje. Włókna często ułożone naprzemiennie – wzdłuż i w poprzek

Helisę kolagenu tworzą trzy polipeptydy (łańcuchy alfa – nie mylić z helisą!) z powtórzeniami sekwencji Gly-X-Y, (glicyna-prolina-hydroksyprolina), bardzo ścisłe połączenie helis, 42 różne łańcuchy alfa zależności od rodzaju kolagen może zawierać identyczne lub różne łańcuchy np.

α1(I) łańcuch α1 z cząsteczki kolagenu I

Geny: COL4A6 łańcuch α6 kolagenu IV

Synteza kolagenu (szorstkie ER) ; prokolagen przenoszony z ER do aparatu Golgiego (gdzie tracone są sekwencje sygnałowe – pomiędzy sekwencjami powstają wcześniej mostki S-S stabilizujące strukturę) i na zasadzie egzocytozy jest wydzielany na zewnątrz powstają włókienka a następnie włókna kolagenowe dodatkowe sekwencje na końcu N i C, dodawanie reszt cukrowych. Wiązania poprzeczne stabilizują strukturę kolagenu

HYDROKSYLACJA PROLINY :

Procesu utleniania proliny dokonuje HYDROKSYLAZA PROLINOWA w której centrum aktywnym znajduje się jon Fe. W celu zredukowania jonu Fe wymagana jest witamina C, brak hydroks. wywołuje szkorbut miedzy innymi uszkodzenie naczyń krwionośnych

Zawijanie zawsze od końca C do końca N, miedzy sekwencjami sygnałowymi powstaja SS stabilizujące, transport do golgiego, utrata sekwencji sygnałowych i na zewnątrz.

Nie wszystkie typy kolagenu tworzą włókna (np. VIII i X heksagonalna sieć, VI nieregularna sieć, IV)

Potrójna helisa kolagenu jest unikatowa! mniej niż 20 innych białek posiada domeny kolagenowe np. białka związane z odpowiedzią immunologiczna( C1q, odinopektyna, fiolina, kolektyna) i acetylocholiesteraza przekazywanie impulsów nerwowych.

Kolagen może posiadać domeny nie kolagenowe na końcu C (cześć z nich jest inhibitorem angiogenezy; fragmenty te hamują guzy)

np.

XVIII - endostatyna,

XV - restyna

IV1α - aresten itd.

CLAC (składnik płytek starczych w alzheimer)

Mutacje w genach kolagenu powodują różne choroby ponad 1300 różnych, większość to mutacje punktowe substytucji - zamiana zasady w DNA, często wymienia jest glicyna, co uszkadza 3-rzędowa strukturę (zatrzymanie skręcania, im mutacja jest bliżej C końca tym większe powikłania)

Choroby:

- pęcherzowe oddzielanie się naskórka (epidermolysis bullosa): 2/100000 urodzeń; fenotyp np.: wiele odmian EB; pęcherze i blizny na dłoniach i stopach, całej powierzchni ciała, syndaktylia; pęcherze w przełyku, układzie oddechowym i odbycie. Nie wszystkie formy EB są wynikiem mutacji kolagenu – np. nieprawidłowa struktura keratyny

-wrodzona łamliwość kości (osteogenesis imperfecta); np. skrajne przypadki złamania przy urodzeniu

- zespół Ehlersa-Danlosa niezwykła ruchliwość stawów i elastyczność skóry,

- inne: chondrodysplazja, zespół Alparta

Choroby mogą być wywołane nie przez mutacje w kolagenie ale też przez wadliwe enzymy modyfikujące kolagen. Choroby spowodowane są wadliwymi enzymami biorącymi udział w obróbce kolagenu.

Inne choroby lista slajd: nie trzeba niby ;)

Kolagen jako biomateriał

Izolacja ze skór świńskich i bydlęcych lub ściegien Achillesa (bydlęcych i końskich)

Zalety: łatwo dostępny, ulega biodegradacji, posiada właściwości hemostatyczne, nietoksyczny, łatwo formowalny, może być łączony z syntetycznymi polimerami, słabo immunogenny – niejasność zleży od stopnia oczyszczenia

Wady: niejednorodny, zawiera zanieczyszczenia, immunogenny, hydrofilny ryzyko chorób prionowych choroba szalonych krów

Najpierw rozpuszczamy!

Włókna kolagenowe można uzyskać metoda elektrostatycznego przędzenia (electrospinning) – rozciąganie roztworu polimeru siłami pola elektromagnetycznego

Wykorzystanie kolagenu w medycynie:

rusztowanie do hodowli tkanek np. rekonstrukcja skóry, naczyń krwionośnych i kości (inżynieria tkankowa) keranocyty i fibroblasty produkujące cytokiny pobudzające podziały
leczenie oparzeń – absorpcja płynu z uszkodzonych tkanek
nośnik czynnika wzrostu naskórka, leków, antybiotyków (błony, filmy, gąbki, kapsułki) i plazmidowe DNA (terapia genowa)

Produkcja „bezpiecznego kolagenu”: rośliny transgeniczne, drożdże itp.

Kolagen syntetyczny: automatyczna synteza peptydów na stałym poziomie.

Rekonstrukcja tkanki kostnej na rusztowaniu kolagenowym

rusztowanie kolagenowe umieszczano w naczyniach z solami mineralnymi (krystalizacja hydroksyapartytu) dodanie osteoblastów In vitro rusztowanie kolagenowe pokryte osteocytami

In vivo u szczura zmodyfikowany kolagen (dodano czynnik wzrostu kości)

Rekonstrukcja tkanki kostnej u szczura …

Produkcja naturalnego kolagenu

rośliny tansgeniczne, hod kom zw i ros, drozdze niepowodzenia bo Malo enymów

Syntetyczny kolagen – automatyczna synteza peptydów na stałym podłożu

Fibroiny

FIBRIOINY SĄ SKĄŁDNIKI JEDWABIU (łańcuch lekki i ciężki) produkowane przez larwy jedwabnika morowego (Bombyx mori). Włókna fibrioiny otoczone są przez serycyny

Fibroiny (spidroiny) jedwab produkowany przez pająki – gruczoły przędne (złoty pająk jedwabny z USA - Nephila clavipes pająk krzyżak).

Materiał sztywny, twardy, nie zwykłe właściwości mechaniczne rozciągliwość pajęczyny do 60%

Właściwości mechaniczne jedwabiu nić wiodąca pion i nić lepka poprzeczna

Nic wiodąca produkowana przez pająka zawiera:

Spidroinę I sekwencja Poli-Ala (~8 monomerów) Gly-Gly-X (~10 powtórzeń)

Spidroina II: -Gly-Pro-Gly-Gly-X-; -Gly-Pro-Gly-Gln-Gln- dużo reszt glicyny + prolina rdzeń!

Jeden pająk może produkować różne rodzaje fibroiny różne białka towarzyszące różne przeznaczenie np. kokon, sklejanie

30% łańcuchów polipeptydów produkowanych przez pająki tworzą beta harmonijki które ulegają częściowej krystalizacji tworzone przez sekwencje polialaninowe. W białku I i II sekwencje Gly-Gly-X tworzą nietypowa helisę 3₁ – rozciągliwość na 1 skręt przepadają 3 reszty aminokwasowe

Pająk jest w stanie w jednym czasie produkować nici o różnym składzie aminokwasowym (7 różnych gruczołów, w pewnym stopniu skład aminokwasowy zależy od diety pająka )

Klonowanie i ekspresja cDNA kodującego fibroiny nici wiodącej w:

E. coli
ssacze
owadzie
transgeniczne larwy jedwabnika
zwierzęta transgeniczne

Nici pajęcze trudna do uzyskania w sposób naturalny (pająki tworzą mniej jedwabiu niż jedwabniki ) uzyskano jednak nici pajęcze w bakteriach, jedwabnikach czy innych organizmach, ale uzyskanie fibroiny z takich hodowli jest problematyczne niskie stężenie oraz problemy w tworzeniu nici o odpowiedniej budowie,

Aparat przędny pająka jest bardzo długi nawet 6cm odcinki z różnymi nabłonkami. Uzyskanie organizmów transgenicznych kozy które produkowały mleko z fibroiną. firma Nexia Biotechnologies Kanada

Włókna uzyskane metodą elektrospinnigu różnią się grubością

Proces powstawania włókien fibroiny (2003 Kaplan) zastosowanie szoku osmotycznego

Zaczynany od kąpieli w glikolu polietylenowego. W tym środowisku in vitro łańcuch ciężki fibroiny ulega odwodnieniu (zmiana konformacji białka) i tworzy micele.

Potem rozcieńczanie roztworu miceli (jak przeciskanie gęstego roztworu przez gruczoł przędny) powstają włókna podobne do nici Bombyx morii 3*

in vitro: różne struktury – filmy, hydrożele, kapsułki, nanowłókna żadna nie ma właściwości mechanicznych naturalnego jedwabiu pająka

Białka jedwabiu są bardzo hydrofobowe we wnętrzu. Elementy hydrofilowe tylko w okolicach końca C i N.

Podczas przędzenia przez pająki spidroiny następuje silne jej zagęszczenie!

Rekonstrukcja nerwów obwodowych (komórki Schwanna są zdolne do opłaszczania włókien jedwabnych)

Inne białka fibrylarne - potencjalne biomateriały

elastyna (kręgowce; owady) – odpowiedzialna za elastyczność skóry i innych tkanek
keratyna
Aktyna i miozyna – skurcze mięsni
Fibrynogen – formowanie skrzepu
Resylina – podobna do elastyny, obecna w wielu narządach
tubulina (Eukaryota – cytoszkielet)
Białaka otoczki wirusowej

Odpowiednie zaprojektowane peptydy mogą powstwać superhelisy tworzące włókna.

BIAŁKA – KLEJE (MAŁŻE)

Niektóre gatunki małży morskich tworzą nici pełniące funkcje kotwicy (służące jednak do przytwierdzania się (klejenia) do podłoża)

b. elastyczne b. włókniste (kolageno-podobne) b. adhezyjne = BISIOR

Omułek jadalny do oderwania należy użyć siły 6-7N (inne gatunki nawet do 200N)

Białka adhezyjne produkowane przez omułka (Mfp – mussel foot protein) zawierają DOPA 3,4-dihydroksyfenylo-L-alanine. Powstaje ona w wyniku hydrooksylacji pierścieni aromatycznych tyrozyny. np. mfp-3 i muf-5 białka odpowiedzialne za przytwierdzenie

Omułki przyklejają się do podłoża (skał), ponieważ DOPA ma zdolność chelatowania jonów metali obecnych na powierzchni skał (grupy hydroksyle DOPA mogą tworzyć wiązania wodorowe z tlenkami metali obecnych w skałach WAŻNE!) !!! „czysta reakcja chemiczna omułka ze skałą” wypowiedź EL.

Włóknisty rdzeń okryty jest twardą kutikulą (rozciągliwość > 70%). Można podnieść omułka na wysokość na dość duża wyskość.

Oddziaływania koordynacyjne między resztami DOPA i Fe³⁺ wiążą poszczególne łańcuchy mfp-1 i powoduje, że kutikula jest odpowiednia twarda

Info dodatkowe:

Cell-Tak „klej” ekstrakt białek adhezyjnych małży wykorzystywany do przyklejania komórek i tkanek do powierzchni szklanych czy plastikowych. Można uzyskać w kom e coli ale trzeba wprowadzić też aparat enzymatyczny który zmodyfikuje tyrozyne do DOPA
Gekony mogą poruszać się po szklanych sufitach dzieki specjalnej strukturze keratynowych włosków pokrywających ich łapy (włoski są zbudowane z beta keratyny) działa to wszystko dzieki siłą vandenrwalsa
Zdolność adhezji do podłoża zależy od sprężystości (pęczki keratynowe wykazują większą sprężystość niż bryła keratyny)
Największa siła adhezji wśród organizmów żywych - Caulobacter cresentus. Laboratoryjne badania wykazały że oderwanie bakterii wymaga 68 N/mm² (1cm² utrzyma 680 kg)

Struktura i rola keratyny- superhelisa, f lamenty pośrednie

białka fibrylarne należące do rodziny filametów pośrednich posiadają alfa heliakalne domeny z powtórzeniami (po 7 reszt posiadających hydrofobowe aminokwasy) , które tworzą superhelisę
cytoszkielet komórki zapewnia jej kształt i twardość (trwałość); składa się na mikrotubule, fi lamenty aktyny, filamenty pośrednie. Budowa filamentów 10nm 2 helisy (struktura superhelisy)
filamenty keratyny łączą się poprzez desmosomy
keratyna może być wykorzystana jako biomateriał, zastosowania podobne do kolagenu (jednak keratyna mniej popularna)
-Keratyna – białko fibrylarne (nierozpuszczalne w wodzie, cząsteczki białka tworzą włókna)
Keratyny są białkami hydrofobowymi, o wysokiej odporności na czynniki fizyczne i chemiczne, a także na działanie typowych enzymów proteolitycznych.
Białka keratynowe cechują się wysoką zawartością aminokwasów siarkowych: cysteina i metionina. Cytokeratyny stanowią największą i najbardziej zróżnicowaną grupę filamentów pośrednich, wchodzącą w skład cytoszkieletu komórkowego.
Podjednostki keratyn zbudowane są według wspólnego planu. Wyróżnia się w nich alfa-helisową domenę centralną oraz globularne domeny N- i C- terminalne. Domena centralna, mająca wysoce konserwatywny charakter, składa się z 310-315 reszt aminokwasowych. Domeny N- i C-terminalne cytokeratyn liczą od 15 do 30 reszt. Podjednostki keratyn asocjując w struktury wyższego rzędu tworzą kolejno: dimery, protofilamenty, protofibryle, a w końcu filamenty pośrednie.

Białka motory molekularne

Przekształcanie energii chemicznej w mechaniczną – najczęściej z udziałem ATP

Zazwyczaj wszystkie te białka składają się z domeny motorycznej, która zużywa ATP i zamienia tę energię w ruch, oraz domeny wiążącej ładunek, która łączy się z przenoszonym obiektem. kinezyna składa się z dwóch łańcuchów. U góry znajdują się dwie domeny motoryczne z ADP. Długi i giętki trzon łączy domeny motoryczne z domenami wiążącymi ładunek na dole

Poruszają się wzdłuż filamentów podczas różnych procesów komórkowych m. in.:

transkrypcja (polimeraza RNA)
translacja (helikaza DNA)
degradacja makrocząsteczek (proteazy, egzonekleazy)
transport organelli ( kinezyny, miozyny)
skurcze mięśni (mioglobina i aktyna)

Prędkość; 10-700 nm/s

Siła hamująca kilka pN = 5-7 pN np. kinezyna

= 25 pN np. polimeraza RNA (najtrudniej zatrzymać)

Kinezyna, deneina, miozyna - aktywny wewnątrz komórkowy transport cząstek, organelli wieloskładnikowe kompleksy wiążące i hydrolizujące ATP

Miozyna porusza się wzdłuż filamentów aktyny a kinezyna wzdłuż mikrotubul.

Transport z udziałem kinezyny bardzo istotny w np. aksonach które mogą mieć nawet metr (transport pęcherzyków z ciała kom do synaps) transport z udziałem kinezy trwa ok. minuty jeśli tylko dyfuzja to kilka lat ( problem gdy kinezyna uszkodzona) choroby neurodegeneracyjne

KINEZYNA – trzy domeny

Głową wiąże ATP – łączy się z mikrotubulami
Domeny wiążące „ładunek”
Domena łącznikowa (przypomina superhelisę)

45 rodzajów ludzkiej kinezyny

Motor na końcu N, C lub w środku

Typ N powzrusza się w kierunki plusa, typ C w kierunki minusa , typ M (motor w środku destabilizacja mikrotubul i rozdział chromosomów)

W jaki sposób poruszają się kinezyny?

Cztery modele:

„inchworm” model – jak gąsienica
symetric hand-over-hand model – superhelisa obraca się wokół własnej osi o 180° raz w jedną raz w drugą stronę
asymtric hand-over-hand model
neck-linker wrapping and unwrapping – jak kroczące zwierzę, superhelisa nie obraca się wokół własnej osi

Badania:

Mikrotubule nie obracają się – superhelisa nie obraca się – kinezyna porusza się jak gąsienica lub asymetric hand-over-hand. Odległość miedzy pozycjami znacznika (fluoresceiny) – 16,6 nm – długość „kroku”~8 nm asymetric hand-over-hand

W: Badania uprawdopodobniły model gąsienicy lub asymetryczny, po dokładnych pomiarach przesunięcia się głów wykazały że prawdziwy jest model asymetryczny (ludzki sposób chodzenia)

Związanie i hydroliza ATP powodują zmiany konformacji i siłę wiązania kinezyny, szyjka łacznikowa w obecności ATP wiąże się z domeną głowy, związanie ATP zwiększa powinowactwo do mikrotubul, druga głowa przemieszcza się do przodu

Kinezyny nie zawsze poruszają się prosto wzdłuż jednego protofilamentu np. NCD zbacza, zmiana aminokwasu w łączniku może spowodować problemy w utrzymaniu kierunki (pijane kinezyny)

Kinezyna hydrolizuje 80 cząst. ATP/s x 8nm = 640 nm/s

miozyna = 8000 nm/s

Info dodatkowe (nie było tego na wykładzie w tym roku ale było w latach wcześniejszych)

Mikrotubule aktyna i filamenty pośrednie tworzą cytoszkielet

Filamenty pośrednie usztywniają kom, chronią je przed mechanicznymi uszkodzeniami

Od mikrotubul zależy właśnie pozycja organelli i transport wewnątrz komórkowy

MTOC miejsce organizacji mikrotubul

Kinezyny na zewnątrz a dyneiny do środka komórki. mikrotubule posiadaja Konce + i –

Włókna aktynowe nadają kształt komórce i są odpowiedzialne za ruch komórki

Cytoszkielet jest dynamiczny (dynamiczna niestabilność) białka mogą występować w postaci monomerów dimerów lub wielkich układów

Mikrotubule są zbudowane z alfa i beta tubuliny tworzą hetero-dimery które układają się po 13 jedne za drugim tworząc protofilamnet beta + (hydrolizuje GTP) alfa –

Mikrotubule to filamenty ulegające ciągłemu wydłużaniu i skracaniu

GTP hydrolizuje do GDP diemr się odłącza jeśli jest pełne stężenie dimerów z GTP i GDP to nić zachowuje swoją długość (polimeryzacja jest spontaniczna) jeśli układ jest mikrotubularny to następuje stabilizacja i nie ma takiego rozpadu łatwego, natomiast koniec może się rozpadać chyba ze powstanie czapeczka zawierają Dimer z GTP

Lek przeciw nowotworowy taksol zakłóca podziały komórkowe utrudniając depolimeryzacje i podział komórki (po działaniu taksolem zbite agregaty mikrotubul)

Motory molekularne : kinezyna, dyneina miozyna

Wszystkie posiadają głowy wiążące się z mikrotubulami stanowi one właściwy motor, cześc odpowiedzialna za utrzymawyanie ładunki i cześć superhelisy łączącej dwa wcześniejsze elementy

Nieprawidłowy transport wzdłuż mikrotubul może być przyczyna choroby

Choroba Charcota-Marie-Tootha typ 2a: dziedziczna neuropatia czuciowo-ruchowa, częściowy zanik mięsni utrata czucia w stopach łydkach, spowodowane to nieprawidłowym transportem mitochondriów w aksonach. Modele zwierzęce: heterozygoty symptomy choroby, a homozygoty umierają w ciągu 30 dni
Choroba Alzheimera (AD) amyloid-beta wydzielany zewnętrze – płytki starcze; wewnątrzkomórkowe zwyrodnienia neurofibrylarne (hiperfosforylowane białko tau); Mutacje w genach preselinin nadprodukcja amyloidu może te z porwadzić do fosforylacji kinezyny KIF5 co upośledza transport mitochondriów pęcherzyków synaptycznych i innych (niezależnie rozwija to chorobę) , nadprodukcja APP lub niedobór APP zaburza transport

Dyneiny

Większość występuje w aksonemach (wici, rzęski) znane tylko 2 cytoplazmatyczne

Migracja jąder komórkowych separacja chromosomów, transport organelli w kierunku minus

Dyneiny należą do grupy białek AAA+ ATpase associated with various celural activity

Dyneiny tworzą łańcuchy ciężki i białka dodatkowe (lekkie i średnio lekkie łańcuchy) organelle posiadają różne białka oddziaływujące z białkami dodatkowymi

Wiele modeli zmian konformacyjnych po związaniu ATP

Choroby zwiane z uszkodzenia dyneiny lub dynaktyne (białko pomocnicze) mogą powodować choroby neuronu ruchowego (stwardnienie zanikowe boczne)

W rzęskach i wiciach dyneina wiąze mikrotubule zorganizowane wg wzoru 9+2+

Działanie dyneiny wzdłuż mikrotubul prowiduje wyginanie się rzęsek

Pierwotna dyskineza rzęskowa – przewlekłe nawracające zapalenie: zatok przynosowych, oskrzeli i ucha środkowego

Zespół Katagenera to samo co wyżej ale u 50% odwrócone trzewia wątroba po lewej serce odwrotnie

Część wirusów np. polio i HSV1 wykorzystują dyneinę w trakcie transportu

Nukleokapsyd HSV wykorzystuję kinezyne do transportu w neuronach

Miozyny- podobne do kinezyny – głowy super helisa i domena wiążąca ładunek

Poruszają się wzdłuż aktyny.

Miozyny 1 i 2 odpowiedzialne za skurcze miesi szkieletowych i serca

Budowa głowy s1 przeważają helisy alfa oraz dodatkowe łańcuchy lekkie usztywniające miejsca wiązania aktyny i wiązania ATP, pętla P konformacyjne zmiany wywołane hydroliza ATP.

Mięśnie – miofibryle- sarkomery- linia Z (aktyna ), strefa H

Nawet 500 glów miozyny w takcie skurczu miozyna wślizguje się między filamenty aktynowe.

Wiązanie i hydroliza ATP powoduje zmiany konformacyjne głów miozyny

Wymiana ADP na ATP utrata powinowactwa do aktyny zmian konformacji (prawa strona); hydroliza zwiększa powinowactwo do aktyny, oddysocjowanie P zmiana konformacji (lewo) przesuniecie

Dwie głowy miozyny działają niemal niezależnie od siebie

Miozyna V uczestniczy w transporcie białek pęcherzyków w komórkach innyh niż mięśniowe np.

-u pełzaków poruszanie się i przebudowywanie nibynóżek

-fagocytoza i wpuklenie błony kom

- stereocila(?) z ucha środkowego wymagają tej miozyny do prawidłowej konformacji

-konieczna do rozwoju melanocytów (transport melanosomów)

- i inne

Miozyna porusza się w sposób podobny jak aktyna ale ma dłuższe elementy łączące wiekszy krok nieco rwany

Choroby wywołane nieprawidłową budowa lub działaniem miozyny

Kardiomiopatia hipertroficzna - mutacje w genie myh7 kodującej łańcuch ciężki beta miozyny, powiększenie serca nagła śmierć, w życiu płodowym jego ekspresja w dorosłym życiu podczas wysiłku np. sportowcy, inni bezobjawowo… powiększenie przegrody serca, włókna mięśniowe chaotycznie ułożone
Choroba Griscellego uszkodzenia układ nerwowego opóźnienie psychomotoryczne (miozyna V)
Celiakia nitolerancja glutenu (miozyna IX)
Syndrom Ushera (typ 1) (miozyna VIIa )

Zaburzenia słuchu i uszkodzenie wzroku (barwnikowe zwyrodnienie siatkówki) słuch od urodzenia wzrok stopniowo się pogarsza

Komórki włoskowate wyspecjalizowane neurony wewnątrz ślimaka posiadają wypustki zwiane ze stereocilaimi (chore maja chaotycznie ułożone zdrowe uporządkowane)

Zwyrodnienie siatkówki u chorego pojawiają się plamy barwnika słabsze naczynia krwionośne, występuje w kom pręcikowych

Możliwe częstsze mutacje w innych genach

Syndrom Ushera terapia genowa (zidentyfikowana mutacja ) lentowirusy jako wektory do wprowadzania genu na mysich kom się udało.

Fałdowanie białek

Paradoks Levinthala (1968)

Każda reszta aminokwasowa może przyjąć 3 różne konformacje (alfa beta i L na wykresie Ramachandrana
Zmiana konformacji trwa ~ pikosekundę

Wykres ramachandrana

Konformacja łańcuch głównego zależy od kątów fi i psi, które mogą przyjmować tylko określone wartości (zależnie od tego jaki ma łańcuch boczny)

Polipeptyd zawierający 150 reszt aminokwasowych, może przyjąć 3¹⁵⁰ = 10⁶⁸ konformacji

Czas potrzebny na odpowiednie fałdowanie 10⁴⁸ lat a w rzeczywistości (in vivo, in vitro) od 0,1 do 1000 sekund (to właśnie paradoks)

Zasada doboru kumulatywnego (Richard Dawkins, „Ślepy zegarmistrz” małpa przepisuje Hamleta (utrwalenie prawidłowych aminokwasów)

Fałdowanie białek nie jest przypadkowe. W trakcie fałdowania białka zostają zachowane częściowo prawidłowe półprodukty

Christian Anfisen – sekwencja aminokwasowa białka określa jego strukturę przestrzenną (badania nad rybonukleaza cielęca) denaturował mocznikiem i beta-merkaptoetanolem, chlorowodorkiem guanidyny) po dokonaniu dializy enzym odzyskał swoja aktywność i strukturę

Modele fałdowania białek- różny stopień ogólności i stosowalności

Np. skurcz hydrofobowy (wszystkie reszty hydrofobowe uciekają do środka ) powstaje molten globule (rozluźniona) forma pośrednia w procesie fałdowania białka (większość II-rzędowa struktura)

nucleation growth
framework model
Jigsaw model – wszystkie drogi są dobre

Obecnie przyjmuje się hipotezę LEJKA wykres energii od różnych konformacji (też amorficzne agregaty i amyloidy)

Polipeptydy są podatne na agregacje

W trakcie translacji nowe powstające polipeptydy eksponują miejsca hydrofobowe
Długi wąski kanał w rybosomie – możliwe łączenie struktur II-rz.

Translacja w komórce prokariotycznej: sekundy

eukariotycznej: minuty

Złe fałdowanie z powodu tłoku molekularnego

Polisomy – w trakcie translacji rybosomy są gęsto upakowane (helikalnie) wzdłuż mRNA

Fragmenty mRNA pokryte przez rybosomy tak ułożone by odległość między nowo syntetyzowanymi polipeptydami była największa

Fałdowanie może zachodzić spontanicznie ale tez często koniecznie SA białka opiekuńcze i izomerazy:

Izomerazy dwusiarczkowe białek (PID)

Izomerazy peptydyloprolinowych 9PPI)

Fałdowanie zachodzi z udziałem białek opiekuńczych i izomeraz dwusiarczkowych bialek (PDI) i peptydyloprolinowych (PPI). PDI katalizują reakcję powstawania mostków S-S (eukariota w ER , prokariota w przestrzeń periplazmatyczna)

Brak prawidłowych mostków S-S zła struktura degradacja

U bakterii mostki ss powstają dzięki Dsb zakotwiczone w błonie komórkowej (B i D) w periplazimie działaja A i C, izomeraza C katalizuje rozrywanie nieprawidłowych mostków S-S, białko A tworzy prawidłowe sama rozrywając swoje S-S. Które są odszykowane dzięki działalności, białka B elektron przenoszony w łańcuchu ubichinon cytochrom na O2

izomeraza dwusiarczkowa białek (PDI) ułatwia przetasowanie wiązań dwusiarczkowych (S-S) przez zwiększenie szybkości wzajemnej wymiany mostków S-S (dodatkowe info – może się powtarzać)

Katalizuje powstawanie mostków S-S- powstają w wyniku utleniania dwóch reszt Cys

(u Eucaryota – w retikulum endoplazma tycznym, u Procaryota w periplaźmie)

W kom. eukariotycznych w ER występuje cała masa białek, tylko 1/3 reakcji to tworzenie SS (1/3 wszystkich białek ulega modyfikacjom. Białka te są następnie transportowane do odp przedziałów kom)
PDI –tworzenie i rozkład SS, regeneracja dzięki różnym białkom Ero1 u ssaków, Aero1 u roślin i inne u innych (wszystkie one wiążą FAD)
Reakcja zachodzi dzięki utlenianiu FAD do FAD2 i elektrony na O2, powstaje H2O
Białka PDI, Dsb, trioredoksyna i transferaza glutationu zawierają domenę trioredoksyny
Domena triordoksyny – C-X-X-C (niski stopień homologii pomiędzy różnymi domenami)
PDI około 0,8% wszystkich białek ludzkich (poza izomerazą pełnią funkcję białek opiekuńczych): oksydaza, reduktaza, izomeraza i białka opiekuńcze)

Izomerazy peptydylo – prolinowe

powstają wiązania cis (reakcje izomeryzacji). Forma cis wiązania peptydowego jest 1000x mniej stabilne niż forma trans, jeśli jednak resztę R2 jest prolina wiązanie cis jest tylko 4x mniej stabilne niż trans
wiele wiąże leki immunosupresyjne

Immunofiliny, cyklofiliny,FKBP

-immunofiliny- są to cytoplazmatyczne białka wiążące immunosupresory (leki które hamują lub zapobiegają aktywności układu immunologicznego) m.in. cyklosporynę A i rapamycynę. Mają aktywność izomerazy peptydyloprolilowej.

-Leki działające na immunofiliny: cyklosporyna, takrolimus, syrolimus (rapamycyna), ewerolimus;

-do immunofilin należą:

Cyklofiliny –wiążą cyklosporynę
FKBP –wiąże Fk506 (takrolimus)
FCBP- wiążą FK 506 i cyklosporynę A (cykliczny peptyd – grzyb Tolypocladium)

-FKBP- funkcja wykracza poza typowe PPI- przekazywanie sygnału, tworzenie kompleksów z receptorami hormonów steroidowych, transport białek i kompleksów, regulacja uwalniania wapnia (receptory IP3)

- FK506 i inne inhibitory PPI mogą być stosowane w leczeniu chorób neurologicznych gdyż ich poziom w mózgu jest wyższy niż w innych tkankach. Fk506 przyspiesza regenerację uszkodzonych nerwów, zwiększa ilość aksonów, zwiększa grubość otoczki mielinowej

-Cyklofiliny CypA wiąże sekwencję Ala – gly- pro – ile w domenie Ca białka Gag wirusa Hiv 1 utrzymuje w konformacji trans. CypA pełni rolę białka opiekuńczego w trakcie tworzenia otoczki wirusa HIV. Funkcja izomerazy cis-trans jest prawdopodobnie zbędna. Cyklofiliny wiążą i aktywują receptory steroidowe (podobnie jak FKBP w aktywności izomerazy)

Rola parwuliny Pin1 w hamowaniu rozwoju choroby alzheimera Pin 1 hamuje powstanie amyloidu B

BIAŁKA SZOKU CIEPLNEGO – heat shock protein (HRP)

Białka opiekuńcze, protezy

HSPs – wykazują bardzo dużą homologię sekwencji aminokwasowej

Grupa białek, których ekspresja wzrasta, kiedy komórki są narażone na działanie czynników stresowych, m.in. podwyższonej temperatury. Produkcja HSP może wzrastać także w odpowiedzi na infekcje, zapalenie, działanie toksyn, promieniowanie UV, głodzenie, niedotlenienie itp. Część HSP jest produkowana w komórce cały czas.

Białka opiekuńcze

fałdowanie nowo-syntetyzowanych polipeptydów
import białek do organelli
degradacja białek niestabilnych
kontrola aktywności białek regulacyjnych
re-fałdowanie nieprawidłowo zwiniętych białek

TRP domeny odpowiedzialne za wizanaie hsp90

Bakterie

~70% białek wystarcza czynnik TF (tigger factor), który wiąże się z rybosomami ma aktywność izomerazy peptydylo-prolinowej

~20% białek wymaga białek DnaK i DNAJ (Hsp70 i 40 gdy dłuższe łańcuchy)

DnaK łapie łańcuch polipeptydowy (hydroliza ATP) zamykanie klapki i silne wiązanie łańcucha NEF czynnik wymieniający nukleotyd wymiana ADP na ATP otwarcie klapki i NEF

~10% jeśli to nie działają układy GroES i GroEL (są niezbędne do życia kom bakteryjnej nie można deletować) (zamyka białko we wnętrzu) re-fałdowanie. Dwa pierścienie i czapeczka (GroES z jednej strony taki pocisk), każda z 7 podjednostek (domen); hydroliza ATP zmiana konformacji(otwór się rozszerza)

Substrat ł. polipeptydowy związany zostaje przez kilka hydrofobowych miejsc pierścienia, GroEL zostaje rozfałdowany w wyniku przyłączenia ATP (i GroES), łapie, rozciąga i puszcza bo GroES konkuruje o związanie reszt hydrofobowych

Zapobieganie agregacji uszkodzonych peptydów i re-fałdowanie

GroEL

Dwa siedmiomerowe pierścienie położone na sobie
Potrzebne białko co- chaperonowe GroES
Związanie substratu i czapeczki determinuje pierścień proksymalny i dystalny

- Działanie:

Istotna hydroliza ATP
Związanie substratu i 7 ATP do pierścienia- substrat oddziałuje z podjednostkami
Przyłączenie czapeczki
Oddziaływania czapeczki z pierścieniem- poszerzenie przestrzeni
Fałdowanie substratu
Hydroliza ATP do ADP powoduje zmiany w dolnym pierścieniu i to on łączy teraz ATP, a od pierwszego pierścienia odłącza się substrat i czapeczka
15 ms- tyle przebywa substrat; źle sfałdowany opuszcza i wchodzi do systemu jeszcze raz albo jest kierowany do degradacji

Nie ma innego systemu przechwytującego źle sfałdowane substraty.

W procesie renaturacji białek z systemem Hsp70 (DnaK-J) uczestniczą Hsp100(np. ClpB przepuszcza przz tunel i umożliwia sfałdowanie przy pomocy DnaJ i K) i Shop

sHSP

masą cząsteczkowa 14000-35000
oligomeryczn struktura
domena α-krystaliny (białka opiekuńcze w soczewce oka ssaków α i β krystality zaćma – agregaty

problem: ciężka struktura krystaliczna do uzyskania)

Główne białka opiekuńcze 9ewolucyjnie konserwowane)

Hsp70 bardzo podobne w budowie i zachowaniu u wszystkich organizmów

Deformylaza – odcina formylo metioninę z łancucha białkowego, częsta obróbka N końca

Drożdże i ssaki posiadają dodatkowe białka Ssz Ssb Zuo oraz jakieś Hsp owiele bardziej skomplikowane

Hsp

Konieczie GrpE (NEF), Hsp wiążą hydrofobowe fragmenty białek,

Hsp70 domena wiązaca Atp cześci wiązącej substrat

Hsp40 np. DnaJ (dmena J i inne bliżej nie poznane)

NEF dimer GrpE Sumer helisa i domena bogata w beta harmonijki

Clp/Hsp100 i sHsp współpracują z wczesniej wymienionymi wazne w podniesionej temp

-Hsp47, tapazyna (?) – wyspecjalizowane białka opiekuńcze

-Hsp47 uczestniczy w fałdowaniu kolagenu, inne białka opiekuńcze pomagające to BiP (Hsp70) oraz PDI nie wiadomo dokładnie kiedy Hsp47 uczestniczy w fałdowaniu (może zapobiegać powstawaniu włókien kolagenowych jeszcze w ER). Jest to jedyne białko, które ma tylko jeden substrat-kolagen

Hsp47 nadprodukowane w narządach (płuca serce wątroba i skóra), gdy zachodzi nieprawidłowe włóknienie, mutacje w tym genie mogą powodować wrodzoną łamliwość kości (gen SERPINNH1) autoantygen w chorobach reumatoidalnych

Tapazyna (TAP associated glycoprotein) białko transbłonowe w ER uczestniczy w składaniu kompleksów MHC klasy I

Białka szoku termicznego biorą udział w regulacji apoptozy i w procesie ontogenezy

Komórki nowotworowe mają często podwyższony poziom Hsp 27, 70, 90 – niezbędne do rozwoju niektórych nowotworów

Hsp mogą powodować odporność na leki (przez hamowanie apoptozy)
Hsp wiąże peptydy pochodzące z białek komórek nowotworowych. Kompleksy Hsp-peptyd rozpoznawalne są przez komórki prezentujące antygen – uaktywnienie odp. immunologicznej

Hamowanie ekspresji Hsp 70 przez siRNA lub antysensowny DNA

- hamowanie rozwoju nowotworu

- wzrost wrażliwości komórek nowotworowych na leki

-ALE też hamowanie odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko białkom nowotworowym)

Lek deksametazol indukuję wewnętrzny szlak apoptozy poprzez zaburzenie potencjału błonowego syntezę rodników tlenowych

Hsp90 – cel leków anty-nowotworowych (mało wiadomo o homologu bakteryjnym, więcej o homologu eukariotycznym)

współdziała z różnymi białkami Hsp 70, 40, hip hop, p23 i innymi

Hsp90 konieczny do wiązania hormonów estrogenów z ich receptorami, powstają złożone kompleksy białkowe które umożliwiają receptorowi przyjecie odpowiedniej konformacji do przyjęcia estrogenu.

Antybiotyk geldanamycyna jest inhibitorem Hsp90 (wiąże się w miejscu wiązania ATP) nie powstają aktywne kompleksy Hsp90 z Hsp70 i 40 i p23.

Geldanamycyna jest podstawa 17AAG nowy lek (faza kliniczna)

Kompleks zawierający Hsp90 oddziałuje z p53 –supresorem nowotworów… p53 hamuje cykl komórkowy indukuję apoptozę i starzenie komórki

Hamowanie aktywności Hsp90 powoduje ubikwitynacji i degradację (tych białek z którymi tworzą kompleks ; przez te białka wzrasta aktywność ATPazy) przez proteosom – proces ontogenezy zachowany. Geldanamycyna nie działa na żywe komórki.

sHsp wiążą się do źle sfałdowanych łańcuchów i przy udziale innych Hsp’ców denaturacja

PROTEOLIZA

- degradacja białek regulowanych

- usuwanie nieodwracalnie uszkodzonych białek

PROTEOSOM 26S (2,5 MDa): Eukaryota, degradacja białek znakowanych ubikwityną. Kontrola cyklu komórkowego, różnicowania, apoptozy, prezentacja antygenu i innch procesów

4 pierścienie po 7 monomerów proteosom 20S – część proteolityczna (CP, 670 kDa)

kompleks 19S część regulatorowa (RP, PA 700 kDa) – rozpoznaje ubikwitynowane polipeptydy

Produkty trawienia białek 3-25 reszt aminokwasowych. Ubikwityna (76 reszt aa). Wiązanie między C-końcem, resztą Gly ubikwityny i grupą ε aminową reszty lizyny znakowanego białka. Kolejne cząsteczki ubikwityny są przyłączane do reszt Lys pierwszej cząsteczki

C-końcowa glicyna z jednej z reszt Lys K6, 11, 27, 29, 33, 48 ubikwitynacji

Znakowanie ubikwityną nie zawsze degradacja np. Lys K63 inne przeznaczenie

Często dodawana jest tylko jedna cząsteczka ubikwityny endocytoza, degradacja w lizosomach

W przyłączeniu ubikwityny pośredniczą 3 enzymy: E1, E2 i E3 (wiązanie tioestrowe)

E3 ma dwa rodzaje:

RING: oddziałuje z kompleksem E2-Ubikwityna

HECT: bezpośrednio wiąże ubikwitynę po przeniesieniu z E2. U ludzi 600 różnych E3 różne substraty

Sama ubikwityna nie jest degradowana, pod koniec następuje deubikwitynacja (odłączenie)

Zaburzenia ubikwitynacji(degradacji białek) CHOROBY:

AD (Alzheimer), PD (Parkinson), HD (Hountigton), schizofremia(?)
Zespół Angelmana (Harry A., 1965) – opóźnienie umysłowe, bezwładność, padaczka, mikrocefalia, zniekształcona twarz (1:10000-40000); 75% mutacji w genie kodującym ligazę (VBE3A (HECT)) E3

Rola proteolizy w nowotworzeniu:

stabilne białka onkogenne nowotwór

RÓWNOWAGA

degradacja supresorów guzów nowotwór

Bortezomib hamujący działanie proteasomu 26S. Białka odpowiedzialne za apoptoze działają dłużej bo nie są degradowane (badania odnośnie szpiczaka mnogiego)

Cenorabdis elegant rozwija się do 1090 kom następnie 131 umiera w apoptozie co daje 956 u dorosłego osobnika.

Zespół Li-Fraumeni- dziedziczna (autosomalna dominująca) predyspozycja do rozwoju nowotworów, czerniaków, białaczek, nowotworów piersi i mózgu, powodowana mutacjami w genach TP53 (kodującym p53) i CHEK2. CHEK2 koduje kinazę białek CHk2, która w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, fosforyluje m.in. p53. Ryzyko rozwoju nowotworu.

Zespół wykryto u około 400 rodzin

-rzadki uwarunkowany genetycznie zespół o typie dziedziczenia autosomalnym dominującym, związanym z mutacją w genie TP53, jednym z najważniejszych genów supresorowych nowotworów, którego brak lub uszkodzenie powoduje zwiększoną podatność (zachorowanie przed 45. rokiem życia) na choroby nowotworowe, a zwłaszcza:

-Gen TP53 (chromosom 17) koduje białko TP53, które oprócz działanie przeciwnowotworowego, wykazuje także działanie hamujące starzenie się komórki.

Wirus HPV powoduje degradacje p53

Wniosek:

Bakterie nie mają ubikwityny – specjalne proteazy zależne od ATP które usuwają nieodwracalnie uszkodzone białka(ClpAP, ClpXP, HslUV, Lon, Fts2).

Eukaryota = proteosom 26S = DEGRADACJA

Choroby konformacyjne / agregacyjne

Wiele chorób jest wynikiem nieprawidłowej konformacji białek i agregacji

Cześć chorób wywołanych brakiem aktywności cha peronów

Pozakomórkowa agregacja białek – ponad 30 rodzajów amyloidoz

Wiele chorób posiada agregaty we wnętrzu komórki (ch. Parkinson - α-synukleina,

ch. Huntingtona – Htt, stwardnienie zanikowe boczne – dysmutaza ponadtlenkowa, AD – białko tau)

I inne

Nieprawidłowo zwinięty polipeptyd ulega degradacji poprzez proteasom – choroba jest wynikiem braku aktywności białka

Choroby – bark aktywności białka

Mukowiscydoza (cystis fibrosis) autosomalna; recesywna

Wielo układowa choroba genetyczna mutacja w genie CFTR (transbłonowy I regulator mukowiscydozy) rozpoznanie w 1989 jest degradowane pomimo zachowania pewnej aktywności

Mutacja powoduje nieprawidłowy transport jonów - zaburzenia układu pokarmowego i oddechowego

Układ oddechowy –polipy nosa zaleganie śluzu i przewlekłe zapalnie płuc szczególnie podczas zakażeń Pseudomonas aeruginosa, S. ureus, H. influenzae

Wątroba – niedrożność dróg żółciowych

Trzustka – zaleganie proenzymów trawiennych

Jelito cienkie – niedrożnośc smółkowa

Uszkodzenie przewodów nasiennych-bezpłodność u 95% mężczyzn

Skóra-gruczoły potowe wydzielają zwiększoną ilość jonów Na+ i Cl-

Wpływa Cl^-, potem Na⁺ (wraz z wodą)

CFTR- glikoproteina, 170 kDa (rodzina białek ABC (ATP binding casette))

Jest kanałem chlorkowym ale reguluje też inne kanały transportujące HCO3- stymulowana przez AMP aktywność kinazy adenylanowej

Transport glutatnionu

Występuje w przewodach żółciowych, gruczołach potowych, jelicie cienkim.

istniehe ponad 1800 mutacji – nie wszystkie dają symptomy. ~70% przypadków to delecja F508 (fenyloalanina). uszkodzony gen u 1:25 osób. delF508 – Dania: 82%, Turcja: 32%, Polska: 54%; 2 mln nosicieli

ENaC- kanał przenoszący NA+

CFTR brak aktywności zaburzenie równowagi jonowej transport Na+ i wody do komórki = zagęszczenie śluzu

100% CFTR delF508 w wyniku nieprawidłowego fałdowania w ER zostaje przetransportowane do cytozo lu, gdzie ulega degradacji.

75%CFTR wt jest degradowane

W fałdowanie białka uczestniczą w ER: kalneksyna, Hsp70 i Hsp90

5 klas mutacji w CFTR

1.nonsens lub przesuniecie ramy odczytu

2.nieprawidłowe modyfikacje lub transport

3.nieaktywne jako kanały brak reakcji na atp

4.nieprawidłowa przepuszczalność Cl

5. złe składanie transkryptu

Diagnoza

Na podstawie charakterystycznych objawów

Test potowy pomiar różnicy potencjałów (Cl-, Na+>60mmol/L)

diagnostyka molekularna w Polsce od 2009 testy przesiewowe – oznaczenie trypsyny we krwi i najczęstszych mutacji w genie CFTR

Biofilm P. aeruginosa przewlekłe infekcje, 90% chorych na mukowiscydozę - zgon

Dlaczego brak aktywnego CFTR obniża odporność na bakterie?

Zahamowanie sekrecji Cl-, intensywna wypływanie Na+ i wody powoduje zagęszczeni i zwiększenie ilości śluzu Zaczynają się pojawiać warunki beztlenowe które sprzyjają rozwojowi mikrokoloni bakterii aż do biofilmu

Zakażenia P. aeruginosa

Białko CFTR może brać udział w aktywacji odpowiedzi immunologicznej poprzez wiązanie LPS. Ekstrakcja LPS do komórek nabłonka poprzez endocytozę to wywołuje przemieszenie czynnika NF-kB do jądra kom co powoduje syntezę cytokin

W obecności glicerolu cześć uszkodzonych białek trafia do błony co powoduje uzyskanie przynajmniej częściowej aktywność.

Okazało się że w długim okresie czasu pojawiły się komórki odporne na odpowiedz immunologiczną cały czas rozwijając się w drogach oddechowych. Bakteriofagi mogą uczestniczyć w kształtowaniu biofilmu

Metody zwalczania przewlekłych infekcji P. aeruginosa

- stosowanie enzymów degradujących algininan ( polisacharyd)

- związki hamujące adhezję

- związki hamujące „quorum sensing”

Terapia

-antybiotyki (1969 8,4 roku w 2000 32 lata)

-leki rozszerzające oskrzela uzupełnianie enzymów trzustkowych odpowiednia dieta fizjoterapia i przeszczepy

Naprawa białka

Ivacofactor: mutacja G551D (ilość CFTR właściwa ale jest „zamknięty” otwiera kanał chlorkowy

Ataluren III: faza badan klinicznych, mutacje nonsens – skrócenie formy CFTR; powoduje błędny odczyt kodonu STOP przez rybosomy i synteza CFTR o pełnej długości

Gentamycyna – antybiotyk powodujący błędy w translacji jako lek stosowany w leczeniu mukowiscydozy. Supresja mutacji

Chemiczne chaperony np. glicerol, fenylomaślan prawidłowe fałdowanie

Terapia genowa: dostarczenie prawidłowej kopii genu przez specjalne wektory: adenonowirusy AAV lub liposomy

Przyczyna wielu chorób (agregacyjnych) może być brak aktywności Hsp

u człowieka sHsp – 11 rodzajów

HspB4 – αA – krystalina – soczewka

Hsp B5 – αB krystalina

Syndrom McKusica_Kaufmana : polidaktylia nieprawidłowa budowa pochwy i macicy, wrodzone choroby serca

Zmiany poziomu sHsp stwierdzono u chorobach Alzheimera, Creufelda-Jacoba, stwardnienia zanikowego bocznego, Parkinsona

dziedziczna neuropatia ruchowa
Charcota-Marie-Tootha porażenie kończyn i zanik mięśni

Zaćma

Wyróżniamy

Krystality alfa opiekuńcza. Mają za zadanie zapobiegać agregacji białek strukturalnych; z wiekiem spada aktywność
oraz strukturalne beta i gama – główne białka soczewki

Mętnie soczewki powoduje osłabnie ostrości i kontrastu; dzieje się tak poprzez modyfikacje krystalin strukturalnych: odcięcie fragmentu białka, deaminacja, utlenienie, glikacja (nieenzymatyczna reakcja dodanie cukrów, charakterystyczne dl organizmów starzejących się) fosforylacja i izomeryzacja.

Soczewka jest przeźroczysta dzięki regularnemu ułożeniu włóknistych komórek

Komórki w soczewce są:

heksagonalne
bez jąder i organelli
zwiększona ilości białek (2x więcej niż w innych tkankach; 30% masy soczewki)
oligomery ściśle upakowane
praktycznie nie aktywne są metabolicznie (degradacja i resynteza nie zachodzi)
część badaczy uważa że w jądrze soczewki dorosłej osoby mogą znajdować się białka tworzone w życiu płodowym .

Modyfikacje potranslacyjne alfa krystalin mogą prowadzić do agregacji białek strukturalnych soczewki gama i beta krystalin, mętnienie soczewki, rozwój zaćmy.

Mutacje α-krystalin:

brak aktywności opiekuńczej (loss of function)
nieprawidłowe oddziaływanie z innymi białkami (gain of function)

Terapia

Hamowanie rozwoju katarakty (badanie na zwierzętach, in vitro)

– leki przeciwbólowe hamują modyfikacje posttranslacyjne np. aspiryna, paracetamol, ibuprofen obniża aktywność α-krytsalin, acetylo L-karnityna zapobiega glikacji, kamozyna hamuje agregację α-krytsalin

Wykład 26.04.2010 choroby konformacyjne/agregacyjne Cd

Desminopatia – αB -krystalina

Desminopatia (przyczyną jest mutacja w genie desminy) - może być wynikiem mutacji w genach alfaB-krysaliny (delecja w przeciwieństwie do delecji alfaA-krystaliny) nie powoduje utraty wzroku

Jednak desmina (białko mięśni ) jeśli jest uszkodzone, agreguje się w mięśniach prowadząc do uszkodzenia serca i mięśni szkieletowych, co powoduje śmierć. Inne białka znajdywane w agregatach to ubikwityna, alfa b_krystalina oraz prekursor amyloidu.

Desmina jest filamentem pośrednim wiąże cytoszkielet z innymi strukturami komórkowymi.

alfaB-krystalina uszkodzona tworzy asymetryczne złogi w mitochondriach, co powoduje wejście na szlak apoptozy

W kom mięśniowych syntetyzowana na dość niskim poziomie, a indukowana w warunkach stresowych (wysiłek), uczestniczy w obróbce transkryptów, oddziaływania z białkami regulującymi proces apoptozy

AlfaB krystalina chroni komórki mięśniowe przed stresem:

-stabilizuje cytoszkielet i miocyty

-w warunkach stresowych jest transportowana do jądra komórkowego i uczestniczy w obróbce transkryptów

-oddziałuje z białkami regulującymi proces apoptozy

Amyloidozy

(virchow XIX w. – amyloid, skrobiopodobny materiał w wątrobie

Polska nazwa Skrobiawice od 20 do 40 rodzajów chorób

27 różnych białek może tworzyć agregaty (m. in. także produkty proteolizy). Różna funkcja, wielkość, struktura 3° i 4°

Amyloid – struktura bogata w poprzeczne arkusze beta białko w tej formie jest niewrażliwe na proteolizę. Tworzenie amyloidu przez łańcuch lekki przeciwciał

sposoby wykrywania: barwienie czerwienią Kongo, kolor zielonego jabłka w świetle spolaryzowanym, immunodetekcja , scyntygrafia

Jak i dlaczego tworzy się amyloid? W in vitro praktycznie każde białko może tak się zachować jeśli znajdzie się w odpowiednich warunkach(nie wiadomo jak się to dzieje w organizmach)

Amyloidozy układowe (systemowe) – agregaty zewnątrzkomórkowe, białka prekursorowe tworzy amyloid w innej takance/organie niż miejsce syntezy

Localized amyloidoses: agregaty białka w miejscu syntezy, wewnątrzkomórkowo lub zewnątrzkomórkowo

E. coli tez ma amyloid – fimbrie curli (polimery CsgA) umożliwa przyleganie do podłoża

Inne to białka z kosmówki w jajach ciem czy też kosmówki i pewnych ryb

Białka o różnej sekwencji aminokwasowej mogą tworzyć podobna strukturę trzeciorzędową

Amyloid może powstawać z białek natywnych (priony, lizozym, transtyretyna) czy też z rozwiniętych

To samo białko może tworzyć różnie wyglądające włókna amyloidu

Polimorfizm włókien amyloidowych – w zależności od warunków mogą powstawać różne formy włókien amyloidowych

Mechanizm tworzenia amyloidu

1.(jakaś) matryca kawałek amyloidu + białka natywne lub częściowo rozwinięte = wiązanie – zmiana struktury(konformacji) indukowane na matrycy = wydłużenie amyloidu

2. Różne konformacjiwiązanie konformacji „okrągłej” przesunięcie równowagiwydłużenie włókna

3. W odpowiednich warunkach pewne konformacje białek wypadają z roztworu w postaci amyloidu, w zależności od warunków powstają różne włókna amyloidu (musi być jakiś ligand)

Dlaczego amyloid jest toksyczny?

Włókna amyloidu uszkadzają strukturę tkanki narządu
toksyczne intermediaty (króteke oligomery) tworzące włókna amyloidu uszkadzają błony komórkowe
Włókna amyloidu wiążą jony metali, co powoduje powstanie reaktywnych form tlenu
We włóknach amyloidu zostają uwięzione białka niezbędne do prawidłowego funkcjonowania komórki

Diagnoza

Objawy kliniczne niewydolność serca, uszkodzenie nerek, neuropatia, hepatomegalia, zespół cieśni nadgarstka, zmęczenie, utrata wagi – EKG, scyntygrafia, echokardiogram biopsja( żołądek, skóra, tkanka tłuszczowa)badania histopatologiczne

Transtyretyna (TTR) – wiąże tyroksynę i retinol w surowicy. Homotetramer 4x55 kDa syntetyzowany głównie w wątrobie. Agregaty (z monomerów) – serce, nerki, układ nerwowy. Ponad 50 mutacji.

Terapia (ATTR)

transplantacja wątroby,

tafamidis – zapobiega dysocjacji tetrameru („chemical chaperone”) TTR i powstawaniu amyloidu (II/III faza badań klinicznych)

AL – amyloidoza pierwotna związana ze szpiczakiem Prekursorem jest łańcuch lekki immunoglobuliny, dyskrazja (nieprawidłowy skład krwi). Najczęstsza amyloidowa powodująca uszkodzenie mięśnia sercowego i nerek prowadzące do śmierci.-brak leczenie

Terapia AL.:

- chemioterapia (melfalan) połączona z przeszczepem komórek pnia z krwi obwodowej

-oligonukleotydy antysensowne, siRNAhamowanie syntezy prekursora amyloidu

-chirurgiczne usuwanie guzków amyloidowychterapia laserowa

Amyloidoza wtórna (AA) białko surowicy A, chroniczne stany zapalne ,50% chorych ma reumatoidalne zapalenie stawów. 8 przypadków na milion w ciągu roku

Agregacja białek jest związana z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi

Choroby prionowe człowieka

Pasażowalne encefalopatie gąbczaste ((TSE)

Scarpie już w 1730 opisana u owiec(zakaźna), około 2 letni okres inkubacji

1940-50 wyklucza teorie o wirusach wszystkie czynniki niszczące nie miały wpływu temp. Fenol i inne

1960 -70 przeniesie z owcy na inne zwierzęta,, pojawia się teoria że to białko

1982 rok teoria priony (tylko białkowa infekcja – białkowe cząsteczki infekcyjne)

PrP- prion protein kodowane przez gen PRNP, wysoki poziom w neuronach i kom gleju, ale i mięśniach

PrPc – izoforma komórkowa występuje w cytoplazmie, wrażliwa na proteazę, nie wywołuje choroby.

PrPsc – izoforma odporna na proteazy forma patologiczna

Nie ma różnic w aminokwasach, ale różnica konformacyjna, PrPsc posiada beta helisy

Choroby prionowe człowieka

ch. Kuru,
ch. Creutzfeldta-Jakoba
Zespół Gerstmanna-Sträusslera-Scheinkera (GSS) – bardzo rzadki zespół neurozwyrodnieniowy, zaliczany do pasażowalnych encefalopatii gąbczastych (TSE) i uważany za odmianę rodzinnej postaci choroby Creutzfeldta-Jakoba (fCJD). Choroba jest uwarunkowana genetycznie i dziedziczna.

Choroby zwierząt

Scarpie – owce, kozy
Pasażowalna encefalopatia bydła (BSE) szalone krowy
Przewlekła choroba wyniszczająca (CWD)

Kuru

Papua Nowa Gwinea 1966 rok wykrycie czynnika zakaźnego plemie Fore w języku oznacza drżeć : drżenie, ruchy mimowolne, zmiany nastroju, „śmiejąca się śmierć” inkubacja około 30 lat

od 1-szych objawów do śmieci 3-12 miesięcy

ch. Creutzfeldta-Jakoba

- depresja, utrara koordynacji ruchów zaburzenia osobowośći, śpiączka

- lata 20 XX w.

Zmiany histopatologiczne w TSE:

- zmiany gąbczaste w istocie szarej

- agregacja PrP^Sc

HISTORIA

1936 wirus (Cuille, Chelle?)

1940-50 – odporny na 100°C, formalinę, fenol, chloroform, przechodzi przez filtry; 41nm nie jest wirusem (?)

1960-70 – może być przeniesiony na myszy i chomiki, odporny na UV (nie zawiera kwasów nukleinowych)

samo aplikujące się białko

1982 – Pruisner – wprowadza nazwę prion – białkowe czynniki infekcyjne

1985 – gen PRNP koduje PrP, wysoka ekspresja w mózgu zdrowych i chorych

PrP^C: izomeraza komórkowa

PrP^Sc: Scarpie, izomeraza patologiczna

PrP^Sc powstaje z PrP^c po zmianie konformacji. Zakotwiczony w błonie przez GPI. Modyfikowanie przez przyłączenie oligocukrów. Część aminokwasowa nieuporządkowana większość helisy alfa. (45% to helisa alfa trochę łańcuchów beta, po zmianie na chorobowe białko 45% beta i 30% alfa helis)

PrP^Sc posiada więcej arkuszy beta (dlatego schorzenie można zaliczyć do amyloidoz). Rozróżnienie na podstawie ciecia proteinazą K, forma normalna się trawi, forma patologiczna w dużej części jest oporna na trawienie. Białko scarpie indukuje transformacje białka komórkowego w formę scarpie. Włókno amyloidu jest zbudowane z trimerów białka scarpie.

1989 – identyfikacja mutacji w genie PRPN

1990 – nadprodukcja PrP u myszy wywołuje neuroderdację

1993 – myszy PRNP (knocking out), które nie produkują PrP^c są odporne na zakażenie PrP^Sc

1994 – wykrycie prionów drożdży, replikacja prionów in vitro (PrP^Sc + PrP^c mała wydajność)

2001- replikacja prionów in vitro – protein misfolding cylic amplification (PMCA). Wykrycie niewielkiej ilości PrP^Sc

Zgodnie z modelem replikacji prionów ( seeding/nucleation model), sonifikacja rozbija agregaty PrP^Sc na mniejsze zarodki, które oddziałują z PrP^c indukując zmianę ich konformacji

2005- PMCA do produkcji PrP^Sc de novo

Techniki wykrywania (PMCA) próbka z organizmu mieszana z białkiem formy komórkowej bonifikacja zmiany konformacji kolejny cykl bonifikacji i zmian konformacji po jakimś czasie mamy dużo agregatów, trawimy, robimy blota i wiemy

Większość prionów namnaża się w centralnych układzie nerwowym, lub narządach limfatycznych (śledziona, węzły chłonne, migdałki)

Okazało się, że replikacja PrP^Sc potrzebuje socjalnych ko faktorów.

Rola różnych kofaktorów różne szczepy tworzą różne strukturalne włókna. Stabilizacja struktury umożliwienie fragmentacji, stabilizacja na zew. org. ułatwienie przetrwania

Przekroczenie bariery gatunkowej

Z owiec (Scarpie) na krowy (BSE) z krów na człowieka (vCJD) bo w paszach były priony, pojawiła się vCJD (wariant choroby Creufelda Jacoba) czas trwania kilkanaście miesięcy (14) chorują młode osoby 20-25 (26) lat średnio, więcej objawów psychicznych, depresje, lęki, halucynacje, przez jedzenie wołowiny z BSE

172 przypadki 4 osoby jeszcze żyją

Funkcja fizjologiczna – delecja nie powoduje widocznych zmian poza opornością na priony, oddziaływania z Hsc70, Hexa, Ncam, GFAP, Ptpn21

Brak białka PrP^c powoduje przewlekła polineuropatie, demielinizację – zmiany w obwodowym układzie nerwowym niezbędne do utrzymania właściwej struktury osłonki mielinowej, kontrola: kanałów chlorkowych, oddziaływania z kinazą tyrozynowa, z receptorem lamiliny (LRP) migracja i różnicowanie komórek, transport Cu2+, albo przekazywanie sygnałów, białko prionowe wiąże się z amyloidem beta, co powoduje zaburzenia działania synaps.

Inaktywacja jednej z ligaz E3 (mahogunin) powoduje encefalopatie podobną do prionowej, brak ubikwitynacji, pojawiają się nieprawidłowe białka prionowe

Propagacja prionów – rola Hsp

Drożdżowe Sub35- czynnik germinacji translacji występuje w 2 formach komórkowej i wadliwej można wymusić zmiany i powstanie agregatów,

Okazało się że powstawanie prionów wymaga powstania Hsp104, Hsp rozbija polimery, ale to powoduje powstanie wielu punktów ,w których mogą się agregować kolejne białka , jeśli jest dość Hsp104 to priony mogą być zbyt niestabilne by powodowały zmiany, ale jeśli Hsp104 zajęte to już problem

Okazało się ze alfaBKrystalina rozbija priony powodując jego propagacje.

Jak przekracza się barierę gatunkową zmiana aminokwasów na pozycjach 138 i 139 jest I Lub M jeśli jest zbieżność możne się przenosić .

Włókna amyloidowe u różnych gatunków wyglądają inaczej, różnią się strukturą

Zmiana sekwencji anminokwasowej PrP umożliwia taką zmianę miedzy gatunkami czysto losowe

Dpl – homologiczne do białka prionowego jeszcze nie wykryto izoformy bez PrP toksyczne

Terapie chorób prionowych

hamowanie rozmnażania prionów i usuwanie PrPsc z zainfekowanych kom
farmakoterapia -pochodne akrydyny i fenotiazyny
przeciwciała anty-PrP. Problem: układ immunologiczny nie rozpoznaje własnego białka o zmienionej konformacji od tego o niezmienionej konformacji
Peptydy częściowo homologiczne do PrP hamują powstawanie PrP^Sc
polisiarczan pentazanu wiąże PrP, wydłuża czas inkubacji „scapie” i zmniejsz podatność myszy na TSE. Styczeń 2003 – po raz pierwszy leczenia pacjenta na vCDJ
chloropromazyna (neuroleptyk feniotiazynowy) i chinakryna (pochodna akrydyny, lek przeciwmalaryczny) hamuje powstawanie PrP^Sc w hodowli tkankowej

Przeciwciało (Fab) hamują powstawanie PrP^Sc w hodowlach tkankowych
Pochodne leków antymalarycznych np. chloropromazyna i chinakryna, im wyższe stężenia tym niższe ilości wadliwych białek ,ale zaburzenia funkcji lizosomy

Peptydy homologiczne całkiem dobrze się sprawdzaj w In vitro, hamują powstawanie PrPsc

W hodowlach tkankowych i In Vito αB krystalina wiąże ^PrPSc

αB krystalina powoduje fragmentację PrP^Sc propagacja prionu wzrost toksyczności

Statyny: indukują Hsp27 i hamują powstawanie PrP^Sc

(statyny głównie jako leki obniżające poziom cholesterolu)

Wniosek: Włókna amyloidowe, które powstają z PrP pochodzących od różnych gatunków różnią się strukturą

Zmiana aminokwasów w sekwencji PrP zmienia strukturę włókna i umożliwia przekroczenie bariery gatunkowej

Szczepy prionowe:

Ten sam gospodarz, różne fenotypy

-umiejscowienie agregatów

-czas inkubacji

-zmiany histopatologiczne

-główne miejsca propagacji

Propagacja prionów – rola Hsp:

-Drożdze zawierają białka prionowe, które nie są szkodliwe dla komórki -np. Sup35-czynnik terminacji translacji

Choroba Alzheimera (AD)

Odkrył Alois Alzheimer w 1906r.

Kolejna choroba w której agregaty występują na zewnątrz komórki i także w wnętrzu komórek

Objawy : nasilające się zaburzenia pamięci, depresja, zmiany nastrojów zaburzania orientacji, drgawki narastające otępienie

35,6 mln chorych w 2010 roku. Liczba chorych podwaja się co 20 lat

Po 65 roku życia co kolejne 5 lat szansa zachorowania wzrasta dwukrotnie

3% ludzi w wieku 65-74

W mózgu chorych obecne są:

płytki starcze (neuritic plaqes) zawierają

amyloid-β (Aβ) oraz uszkodzone nurytu kom mikrogleju i astrocytu

wewnątrzkomórkowe zwyrodnienia neurofibrylarne zawierają hiperfosforylowne białko tau które tworzy pary heliakalnych(PHF)

Funkcja tau stabilizacja mikrotubul, transport w aksonach

CLAC (colagen like Alzheime amyloide plaque komponent)

Prekursorem CLAC jest CLAC-P kolagen typu xxv CLAC 3helisa wystepująca w u chorych na alzheimera i downa

Prekursorem Aβ jest APP(jest to białko transbłonowe o nieznanej funkcji, zachowane ewolucyjnie u wszystkich znanych ssaków możliwe że jest odpowiedzialne za transport jonów i regulację wzrostu

Występują 3 izoformy znacznie różniące się wielkością. Prekursor APP jest cięte przez alfa-(tnie w obrębie Aβ beta- i gamma- sekretazy

Cięcie przez alfa- uniemożliwia powstanie amyloidu. Pozostałe wycinają fragment odpowiedzialny za powstanie amyloidu powstają dwie formy Aβ40 i Aβ42 (teni na wieksze gamma)

Sekretaza-γ to kompleks zakotwiczony w błonie, składa się z 4 białek: preseniliny 1 i 2 (PS1 i PS2 to one są odpowiedzialne za ciecie), nicastriny-2, Aph-1 i Pen-2.

Hipoteza kaskady amyloidowej jeśli zaburzenie w degradacji lub powstaje wiecje prekursora

Struktura Aβ uzdo arkuszy beta

Większość przypadków AD- sporadyczna np. geny ryzyka - APOE, CLU (APOJ) CR1 PICALM1

15% rodzinna (FAD) forma wywołana mutacjami w genach APP lub presenilin

Trisomia 21 - Syndrom downa – objawy choroby Alzheimera (3 geny odpowiedzialne za produkcje APP co wywołuje nadprodukcję Aβ

Białko tau ( 6 izoform) jest rozpuszczalne uczestniczy w tworzeniu i stabilizacji mikrotubul

W AD jest hiperfosforylowane (obniżenie powinowactwa do mikrotubul) i tworzy zwyrodniałe neurofibryle. Agregaty pojawiają się też w innych chorobach.

Obecność białka tau jest niezbędna do degradacji neuronów indukowanej przez Aβ. Gdy nie ma białka tau sieć mikrotubul jest nienaruszona nie ulegają degradacji.

Pojawienie się dużych ilości oligomerów może uszkadzać synapsy

26 mutacji w genach APP może powodować wzrost poziomu Aβ40 i Aβ42 (bardziej toksyczny)

Mutacje w genach presenilin (2010r)178 mutacji (substytucje, delecje, insercje)

zmiany miejsca cięcia więcej Aβ42 niż Aβ40

Rola ApoE i cholesterolu w rozwoju AD

Allele APOE: ε 2, 3 i 4(ten nawet pojedynczy zwiększa ryzyko)

Apolipoproteina E jest głównym transporterem cholesterolu, transport materiału do naprawy błony oraz przebudowy np. reorganizacja dendrytów

Nadciśnienie tętnicze i wysoki poziom cholesterolu we krwi sprzyja rozwojowi demencji, u chorych na AD wysoki poziom cholesterolu we krwi ale niski w błonach neuronów

ApoE4 łatwiej niż E2 i E3 przyjmuje strukturę rozluźnioną – globularną, która może być toksyczna dla neuronów

W tkance mózgowej chorych na AD – fragmenty ApoE4 transport Aβ40 i Aβ42 do komórki uszkodzenie neuronów. W: ApoE4 uszkadza błony i umożliwia transport amyloidu do komórek

ApoE - białko opiekuńcze hamuję agregacje Amyloidu beta lub tez ułatwia jego degradacje

Fragmentacja ApoE4 brak funkcji opiekuńczej

in silicie kompleks ApoE4-Aβ( w kompleksie utrudnia degradację Aβ) ma inną konformację niż ApoE2-Aβ i ApoE3-Aβ

Synteza cholesterolu

reduktaza HMG-CoA obniżana aktywność w mózgu u chorych na AD. Cholesterol obniżony w korze i hipokampusie chorych na AD

Cholesterol lub jego estry zmniejsza aktywność α-sekretazy, zwiększając jednocześnie aktywność β i φ sekretazy.

Clusteryna białko opiekuńcze w zależności od stosunku CLU do amyloidu beta hamuje lub indukuje agregacje toksyczności

Hsp – wzrost poziomu w astrocytach, neuronach, płytkach starczych, doświadczenia prowadzone w warunkach in vitro sugerują ze hamują agregację amyloidu (40,70,90 i sHSP). Nadprodukcja sHsp hamuje toksyczność Aβ

Geldanamycyna (inhibitor hsp90) indukcja innych hsp i brak agregacji białka tau

Dlaczego Aβ agreguje w neokorteksie?

Jony metali indukują powstanie złogów, w warunkach fizjologicznych oddziaływania z jonami miedzi, żelaza i cynku

Płytki w korze nowej bo z wiekiem wzrasta poziom cynku (częściej u kobiet bo tam aktywność transport cynku jest podwyższona)

myszy i szczury nie chorują (?) bo nie maja histydyny która wiąże się z jonami metali.

W: Aβ związany z błonami ZDROWY ; Aβ rozpuszczalny (zdegradowany) CHOROBA

AD nadmiar jonów metali wiązany jest przez Aβ

Terapia:

statyny i inne leki obniżające poziom cholesterolu,
czynniki zmieniające konformacje ApoE4,
aktywatory α-sekretazy,
inhibitory β i φ sekretazy,
peptydy i związki chemiczne hamujące powstawanie agregatów
związki wiążące jony metali (kliochinol)
antyoksydanty i indukcja Hsp, związki wiązące jony metali, związki zapobiegające agregacji, przeciwciała.

Myszy już można zaszczepić przeciw Aβ42, zapobiega agregacji jak tez rozbija już powstałe

Kolostrynina – kompleks 30 peptydów bogatych w prolinę izolowany z siaryowic hamuje powstawanie złogów amyloidowych

PrP^c jest receptorem Aβ

Choroby poliglutaminowe

Choroba Huntingtona

1872 – dziedziczna autosomalna; dominująca

Objawy

zaburzenia koordynacji ruchowej
ruchy mimowolne
depresja
drażliwość
labilność emocjonalna
trudności w planowaniu
dysartria (zaburzenia mowy)
i inne

Częstość: 3-7/100 000

Często następuje zanik zwojów postawy

Powodowana przez mutacje w genie kodującym huntingtynę (Htt, 350 kDa) u zdrowych w eksonie 1 około 35 kodonów CAG kodujących glutaminę (Q) im więcej powtórzeń tym większa szansa na wcześniejsze objawy

CAG < 35 ZROWY

CAG 35-39 może się rozwinąć lub nie

CAG 40-60 pierwsze objawy po 40 roku życia

CAG >60 przed 20 rokiem życia

Diagnostyka – testy genetyczne z zastosowaniem PCR

Inne choroby poliglutaminowe: ataksje rdzeniowe-móżdżkowe (SCA): niezborność, bezwład, zaburzenie koordynacji

Struktura HEAT repeats (od nazwy pierwszych liter białek w których znalezione te struktury) mnóstwo helis i superhelis

Htt może ulegać modyfikacji:

ubikwitynacji
palmitylacji
fosforylacji
acetylacji - CBP

Jaką role pełni

Produkowana prawie we wszystkich tkankach, w komórkach i wszystkich organellach. Funkcje:

regulacja transkrypcji
transport RNA
rola w embriogenezie
uczestniczy w przekazywaniu sygnałów
transporcie i wytwarzaniu pęcherzyków synaptycznych
endocytozie (Htt jest częścią kompleksu wiążącego endosomy z mikrotubulami w aksonach)
oddziałuje z wieloma białkami (np. CBP, p53)

Htt^ex tworzy agregaty w jądrze komórkowym i cytozolu neuronów

Skrócona forma Htt^ex jest toksyczna dla komórki (Htt^ex w czasie choroby ulega częściowej degradacji coraz częściej agregacja) mutacja gai of function nabywanie funkcji

Htt^ex zaburza prawidłowe funkcjonowanie komórki

Proteosom nie może pełnić swojej funkcji (degradacji). Hsp też nie mogą spełniać swojej funkcji.

Agregaty Htt^ex powodują uwalnianie z mitochondriów – cytochrom c – sygnał do apoptozy

Htt^ex hamuje transkrypcję PGC1α czynnik transkrypcyjnego odpowiedzialnego za syntezę białek mitochondrialnych i BDNF (brain-derivied neurothopic factor ) główny czynnik odpowiedzialny za budowanie neuronów (właściwa struktura aksonu)

Struktura agregatów poli-Q

nanorurki wypełnione wodą
włókna poli-Q są stabilizowane przez w. wodorowe pomiędzy gr. COOH łańcucha głównego i NH₂ łańcucha bocznego
stabilna struktura tworzy sekwencje zawierające > 40 reszt Q

Rola HSP w usuwaniu agregatów i zapobieganie toksyczności poliQ

- modele drożdży i C. elegant

Hsp 40 i 70 hamują powstawanie włókien Htt^ex 153Q in vitro

Cenorabdis elegans nicień zawierał rekombinowane białko Htt ze znacznikem im więcej glutaminy tym większa agregacja, normalne białka agregują po dłuższym czasie

W: Agregacja i toksyczność poliQ zależy od liczby Q i wieku organizmu (np. nicienie C. elegant) przestają się poruszać

Terapia

Indukcja syntezy Hsp które działa na 2 sposoby z jednej strony zapobiegają agregacji a z 2 pomagają w degradacji białek.

Łatwo można wymusić zwiększenie produkcji Hsp jeśli zablokujemy Hsp90 (geldanamycyną, 17AAG) powoduje to wzrost ilości innych Hsp bo Hsp90 kontroluje negatywnie HSF1 (czynnik transkrypcyjny kontrolujący geny innych Hsp)

Leki te hamują agregację Htt… indukcja produkcji Hsp może być wywołana poprzez inne leki np. statyny (inhibitor enzymu odpowiedzialnego za syntezę cholesterolu)

Biała zawierające poliQ wiążąc CBP (acetylotransferaza histonowa) może to powodować hamowanie transkrypcji części genów… jeśli użyć inhibitorów deacylazy histonowej może przywrócić normalny stan innych białek w kom.

Agregacja Htt może być hamowana przez specyficzne przeciwciała produkowane w komórce = intrabody (wprowadzono na odpowiednim wektorze)

Peptydy supresorowe hamują agregację poprzez klejnie się do uszkodzonego fragmentu co uniemożliwia powstawanie agregatów (rozdziela przestrzenie hamuję powistawie beta)

Czerwień Kongo hamuje powstawanie agregatów nie stosuje się jej gdyz jest toksyczna

Oligonukleotydy sDNA bogate w G (4xG) tworzą się kwadrupleksy hamujące powstawanie złogów Htt

Choroba Parkinsona

1.ciało Lewy’ego i alfa-synukleina (im wyższy poziom alfa-synukleiny…)

2.mutacje PARK1 (alfa-synukleina) i PARK2 (parkina)

3.zmutowana alf- synukleina blokuje autofagię z udziałem białek opiekuńczych

4. Parkina uczestniczy w usuwaniu uszkodzonych mitochondriów

5. Parkina uczestniczy w ubikwitynacji białek

Parkinson

Objawy: sztywność mięśniowa, baradykineza (spowolnione ruchy), drżenie spoczynkowe, trudność inicjacji ruchów dowolnych, zaburzenia równowagi, brak mimiki twarzy, mikrografia (coraz mniejsze litery), przodopochylenie tułowia.

W Europie-1,6% os powyżej 60 roku życia cierpi na chorobę Parkinsona

Przyczyna choroby: Zmiany zwyrodnieniowe neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej. W istocie czarnej neuromelanina syntetytozowa z L-DOPY prekursora dopaminy. U chorych brak L-DOPY –zanik neuromelaniny

Degeneracja neuronów dopaminergicznych:

-Objawy choroby pojawiają się po utracie około 50% neuronów dopaminergicznych, zdrowy traci 5% na 10 lat

Dopamina- neuroprzekaźnik katecholamin owy, syntetyzowana i uwalniana przez neurony w mózgu.

W regulacji ilości biora udział MAO – monoamine oxidase, oksydaza monoaminowa (degraduje dopaminę w komórce i poza komórką)

L-dop- przekracza barierę krew mózg, a dopamina nie

W preparatach tkanki nerwowej – ciała Lewy’go agregaty zawierające alfa-synukleinę, ale tez parkinę, neurofilamenty, alfabeta krystalinę, LRRK2

Caiała Lewy’go nie zawsze występują u chorych na chorobę Parkinsona, mogą występować tez przy innych chorobach neurodegeneracyjnych, oraz około 10% tworzy te ciała bez objawów

Większość przypadków jest spontaniczna ale 10-15%jest dziedziczne

Mutacje PRK 1 – alfa synukleina (lewy)

Park2 parkina

Park7 DJ1

PARK dardaryna, LRRK2

UCHL1-uwalnia monomery ubikwityny

Mutacje wywołujące Parkinsona

-PARK1 – koduje alfa-synukleinę / ciała Lawyego +

-PARK2- koduje parking /ciała :awy’ego –

PARK1-autosomalne, dominujące, w genie kodującym alfa-synukleinę (140 reszt aminokwasowych), której agregaty tworzą ciałka Lewyego

Ekspresja alfa-synukleiny zachodzi w różnych częściach mózgu

-zwielokrotnienie liczby genów a-synukleiny, może również wywołać Parkinsona!

Nadprodukcja a-synukleiny u muszy wywołuje PD:

-od poziomu a-synukleiny zależy wiek , w którym zaczyna się rozwijać PD oraz objawy

-im wyższy poziom a-synukleiny –tym ostrzejszy przebieg choroby

Jeśli alfa-synukleina jest uszkodzona szybko agreguję, małe białko (140 aminokwasów) Glowie w zakończeniach synaptycznych

Średni wiek pojawienia się choroby 46 lat, trwa około 9 lat… stwierdzono zwielokrotnienie kopi genu 3 do 4 krotnie, im wyższy poziom synukleiny tym szybszy przebieg choroby

Nie wiadomo co robi synukleina, gdyż delecja nie daje żadnych widocznych objawów

Autofagia: naturalny proces degradacji białek, ok. 1/3 białek ulega degradacji we wnętrzu komórki, pozwala to usunąć wadliwe białka, czy te które wniknęły do komórki, białka opiekuńcze kierują do lizosomów. Jelni te posdaja receptor LAMP2A

Przypuszcza się ze wadliwa alfa-synukleina blokuję autofagię z udziałem białek opiekuńczych zapychając LAMP 2A, powstaje korek zatykający,inne białka nie są przez to degradowane…

Wynikać z tego może że agregaty to mechanizm obronny przed szkodliwymi białkami.

Białka szoku termicznego hamują powstawanie agregatów .

PARK2 mutacje autosomalne recesywne w genie parkiny które powoduja AR-JP

Głowne mutacje to delecje eksonów insercie mis sens) średni wiek 26 lat

Parkina (42kDa) jest enzymem E3 (ring type) ligaza ubikwityny, który uczestniczy w znakowaniu ubikwityną białek do degradacji.

Rola parkiny w ochronie neuronów dopaminergicznych (ubikwitynacja czynnika indukującego apoptozę) lub uszkodzona nie wspomaga sprzątania uszkodzonych białek, które zaczynają tworzyć agregaty.

Okazało się że parkina bierze udział w usuwaniu uszkodzonych mitochondriów (mutacje w mtDNA, stres oksydacyjny, toksyny) , może dojść do śmierci komórki lub tylko do autofagii uszkodzonego mitochondrium

Parkina rozpoznaje uszkodzone mitochondria przy pomocy CCCP

CCCP i inne jonofory przerywają sprzężenie transportu elektronów z fosforylacją- przenoszą protony przez błonę. Transport protonów jest prawidłowy, ale spada energia i nie ma syntezy ATP

Parkina jest niezbędna w trakcie kierowania autofagosomów do uszkodzonych mitochondriów

Uszkodzone mitochondria znikają z komórek, w których znajduję się parkina

Prawdopodobnie znakowane jest białko PINK1 znajdujące się w błonie mitochondriom, co powoduje kierowanie do degradacji

Parkina uczestniczy w autofagii uszkodzonych mitochondrów

DJ1 (gen park7) aktywność antyoksydacyjna, antyapoptotyczne, białka opiekuńcze i wiążące RNA… Hamuje agregacje alfa-synukleiny, brak danych na którym etapie agregacji działa

Występuje w mitochondrium jeśli cysteina 106 zostaje utleniona

LRRK2 (park 8) dardaryna kinaza (ser/thr) zależna od GTP, zdolna do autofosforylacji, oddziaływania z innymi białkami i błonami… jeśli zmutowana to wzrasta aktywność kinazy, mogą powodowac spadek aktywności GTPazy, możliwa intensywna fosforylacji alfa-synukleiny

Szereg białek związanych z chorobą Parkinsona odpowiada za prawidłowe działanie mitochondriów.

Przyczyna niektórych chorób neurodegeneracyjnych może być stres oksydacyjny wywołany przez

niedokrwienie i reperfuzję, Parkinson, Alzheimer, stwardnienie zanikowe boczne (O2-; H2O2;- OH; NO-; ONOO- ;tzw. ROS) mogą wywoływać apoptozę lub nekrozę

Śmierć komórki-stres oksydacyjny-uszkodzenie lipidów, białek, DNA, RNA

ROS… powstają w mitochondriach w sposób normalny, nawet 10% cząstek tlenu z atmosfery, cześć rodników około 2% ucieka z mitochondriów… ale też wydzielane przez fagocyty niszczące bakterie

Trafia się też, że podczas metabolizmu tłuszczów,ale większość trafia na katalazy w peroksysomach

Reakcja Fentona Fe2+ H2O2 = woda i HO (nie ma enzymów wałczących z tym rodnikiem)

Glutation, dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza i peroksydaza zabezpieczają kom przed rodnikami

ROS a Parkinson

Stwierdzono obniżenie poziomu glutationu GSH, wzrost stężenia żelaza (reakcja Fentona), obecność peroksydacji lipidów, 8-hydroksyguanozyne produkt oksydacyjnego uszkodzenia DNA

Dopamina ułatwia powstawanie rekatywnych form tlenu, źródłem Fe2+ pochodzi z neuromelaniny (90% komórek w istocie czarnej zabarwionych melaniną)

Pirydyna MPTP – powoduje objawy choroby Parkinsona… w astrocytach przekształcana z MPTP do MPP- ( hamowanie oddychania mitochondriów wzrost reaktywnych form tlenu)

Lecznie choroby Parkinsona

-Podanie L-DOPY, inhibitory dekarboksylacji DOPA skuteczne na wczesnych etapach leczenia,… -----inhibitory oksydaz monoaminowej B,…

-przeciwutleniacze (zwykła witamina C)

-leczeni chirurgiczne,…

-Pochodne leków immunosupresyjne, terapia genowa, przeszczep neuronów, indukcja Hsp

Stwardnienie zanikowe boczne

1.Dysmutaza ponadtlenkowa (ZnCuSOD)-jakie funkcje pełni? Jakie są skutki mutacji SOD?

2.Pochodne hydroksyloaminy (bimoclomol/arimoclomol) mogą znaleźć zastosowanie w leczeniu chorób: Parkinsona, Alexandra i ALS (i innych…) Jakie jest ich działanie?

Stwardnienie zanikowe boczne (ALS- amytrophic Lateran sclerosis)

Choroba Lou Gerhiga

Objawy:

-degeneracja neuronów motorycznych w mózgu i rdzeniu/korze, pniu mózgu i rdzenia kręgowego

- zmęczenie i drżenie mięśni, zwiększone napięcie mięśniowe, osłabienie kończyn zaburzenia połykania, niewydolność oddechowa, zanik mięśni

- częstość zachorowań 3 na 100 000 wiek 40 -50 śmierć po 2 do 5 lat

Większość przypadków sporadyczna (90-95%) (SALS)

Około 10% to forma rodzinna (FALS) z tego 20% przypadków związanych z mutacja w SOD1 kodującym dysmutazę ponadtlenkową CuZnSOD

Wykryto blisko 122 mutacje w genie SOD1- większość powoduje zamianę aminokwasu i ma charakter autosomalny dominujący

CuZnSOD (homodimer 32kDa około 1% białek w komórce) obecna jest w cytozo lu, jądrze, przestrzeni miedzy błonowej mitochondriów komórek eukariotycznych i w przestrzeni periplazmatycznej bakterii

U człowieka występują jeszcze MnSOD (SOD2 mitochondria) i SOD (pozakomórkowa)

Ludzkie dysmutazy ponadtlenkowe: CuZnSOD(SOD1)

MnSOD(SOD2, mitochondria)

SOD(SOD3 ZnCu,pozakomórkowa)

Uczestniczą w usuwaniu reaktywnych form tlenu.

Modyfikacje potranslacyjne

Wiązanie CU (wymaga białka opiekuńczego CCS), wiązanie Zn (metalotioneina-białko opiekuńcze) tworzenie mostków SS (CCS-copper chaperon for COD1), dimeryzacja

Mutacje w SOD1: zmiana ładunku białka, brak wiązania jonów metali, destabilizacja struktury dysmutazy ponadtlenkowej, agregacja izolowane z tkanek pacjentów chorych na FALS zawierają poza SOD1, ubikwitynę i białka neurofilamentów.

Agregaty w neuronach motorycznych chorych na ALS nie musza zawierać SOD1

Zmutowana SOD1 wykazuje mniejsze powinowactwo do Zn2+

-destabilizacja struktury SOD1

-nieprawidłowa redukcja Cu2+ do Cu+

-zredukowana forma enzymu Cu+SOD-katalizuje reakcje prowadzące do syntezy ROS

Zdaję się iż ani agregaty ani formy pośrednie nie wpływają negatywnie na funkcjonowanie neuronów, ale zmniejszenie powinowactwa do Zn destabilizacja struktury powoduje do nieprawidłowej redukcji Cu2+ do Cu+ może wrócić do prawidłowego jonu miedzi jeśli będzie reagować z O2, ale to powoduje syntezę rodników tlenowych(odwrócenie funkcji)

Rola Hsp w rozwoju FALS

Białka Hsp70 i Hsp27 odnajdywano w agregatach. Tworzą agregaty ze zmutowaną formą SOD1 (pozbawioną Zn i Cu. Zmutowana SOD1 konkuruje z czynnikiem indukującym apoptozę (AIF) o wiązanie z Hsp70

Agregaty SOD1 „inaktywują” proteasom i białka opiekuńcze.

Przyczyną ALS mogą być nieprawidłowe modyfikacje prekursorowego mRNA, powodujące nadaktywność receptora glutaminianu

Terapia

Indukcja syntezy Hsp np. arimoclomol, który indukuje syntezę Hsp poprzez stabilizacje czynnika HSF-1 który rozpoznaje operony z Hsp indukując ich syntezę

Aromoclomol indukuje fosforylację czynnika transkrypcyjnego HSF i syntezę Hsp

Aktywność proteasomu, która pozwala na usuwanie SOD1 w neuronach rdzenia kręgowego spada wraz z wiekiem -> objawy ALS pojawiają się w późnym wieku

Choroba Alexandra (leukodystrofia)

1.Włókna Rosenthala, białko GFAP (jaką rolę pełni?)

Choroba Akexandra

Choroba neurodegeneracyjna wywołana dominującą mutacją w genie kodującym kwaśne białko włókienkowe gleju – GFAP większość przypadków AXD jest sporadyczna

-leukodystrofia- uszkodzenie istoty białej w mózgu, nieprawidłowa otoczka mielinowa

-wodogłowie

- w astrocytach pojawiają się włókna Rosenthala, które zawierają GFAP, wimentyne, ubikwitynę alfaB-krystaline i Hsp27, plektynę

Objawy pojawiają się już u noworodków np. padaczka, wodogłowie i szybka śmierć przed 2 rokiem życia

… mogą tez pojawić się w okolicach 6 miesiąca życia makrocefalia, niedorozwój umysłowy

…po 8 miesiącu-postępujący niedowład, paraliż oddechowy

U dorosłych podobne do stwardnienia rozsianego

GFAP jest markerem astrocytów… komórki glejowe wspomagają komórki nerwowe jest ich 10x więcej niż neuronów, astrocyty są najliczniejsze, komórki glejowe zapobiegają dyfuzji neuroprzkazników poza szczelinę, transport glukozy

GFAP – należy do fi lamentów pośrednich, obecne przede wszystkim w astrocytach centralnego i obwodowego układu nerwowego (włókna Rozenthala tylko w ośrodkowym(centalnym) )

Włókna Rozenthala często wokół naczyń krwionośnych

W trakcie rozwoju mózgu zmniejsza się ilość wimentyny na korzyść GFAP

Zmutowane GFAP powoduje uszkodzenie cytoszkieletu

Zmutowane GFAP powoduje indukcję alfa beta-krystaliny, która wiąże się do włókien Rosenthala

Brak alfaB-krystaliny nie powoduje powstawanie włókien Rosenthala, ale znacznie obniża przeżywalność, natomiast nadprodukcja alfaB-krystaliny spowalnia powstawanie włókien i wydłuża czas życia (obniża śmiertelność i hamuje powstanie wł. Rosenthala u myszy transgenicznych produkujących zmutowane GFAP), okazało się też że obecność alfaB-krystaliny hamuje odpowiedź stresową w centralnym układzie nerwowym u myszy nadprodukujących ludzkie GFAP

Składniki włókien Rozenthala są poza GFAP i sHsp jest też plektyna (która zapobiega agregacji GFAP). Plektyna białko łącznikowe w cytoszkielecie.

Parkinson

Objawy: sztywność mięsniowa, baradykineza _spowolnone ruchy, drżenie spoczynkowe, trudnośc inicjacji ruchów dowolnych, zaburzenia równowagi, brak mimiki twarzy, mikrografia (coraz mniejsze litery), przodopochylenie tułowia. europie 1.6% osób po 60 chorych

Zmiany zwyrodnieniowe neuronów dopamienigiczneych w istocie czarnej. W istocie czarnej neuromelanina syntetytozowa z L-DOPY.

Objawy choroby pojawiają się po utracie ok. 50% neuronów dopinoergicznych. Zdrowy traci 5% na 10 lat. Chory 12% na rok.

Dopamina- neuroprzekaźnik katecholaminowy syntetyzowana i uwalnia a przez neurony DOPA OUN w mózgu.

Syntetyzowana z l-DOPA. PET bada poziom l-dopa ( także spect) W regulacji ilości biora udział MAO – monoamine oxidase, oksydaza monoaminowa

W preparatach tkanki nerwowej – ciała Lewy’go agregaty zawierają alfa-synukleinę ale tez parkinę, neurofilamenty, alfaB krystalinę, LRRK2 i hsp 27. Mają charakterystyczny obraz – pierścienie.

Caiałą Lewygo nie zawsze występują u chorych na chorobe Prkinsona, mogą występować tez przy innych chorobach, oraz ok. 10% populacji tworzy te ciała ale jest to bezobjawowe

Wkiększość przypadów jest spoardycza Lae jst też rodzina

Większośc przypadków jest spontaniczna ale 10-15%jest dziedziczne

Mutacje PaRK 1 – alfa synukleina (lewy)

Park2 parkina dotyczą sytyłacji kiedy nie powstją ciała L. rodzina

Park7 DJ1

PARK dararin, LRRK2

Jeśli alfa-sunukleina jest uszkodzona szybko agreguję, małe białko (140 aminokwasów) Glównie w zakończeniach synaptycznych

Średni wiek pojawienia się choroby 46 lat, trwa około 9 lat… stwierdzono zwilokrotnie kopi genu 3 do 4 ktornie, im wyższy poziom synukleiny tym szybszy przebieg choroby

Nie wiadomo co robi synukleina gdyż delecja nie daje żadnych widocznych objawów

a-S bierze udział w: Autofagia 1/3 białek ulega degradacji we wnętrzu komórki, pozwala to usunąć wadliwe białka czy te które wniknęły do komórki, białka opiekuczne kieruja do lizosomów Jelni te posdaja receptor LAMP2A

Przypuszcza się ze wadliwa alfa-synukleina blokuję autofagie z udziałem białek opikucczych zapychając LAMP 2A powstaje korek zatykajacy inne białka nie są przez to degradowane. śmierć komórki zaprzestanie autofagi…

Wynikać z tego może że agregaty to mechanizm obronny przed szkodliwymi białkami.

Białka szoku termicznego hamują powstawanie agregatów .

PARK2 mutacje autosomalne recesywne w genie parkiny które powodują AR-JP

Głowne mutacje to delecje eksonów insercie mis sens) średni wiek 26 lat rodzina PD brak ciałek Lewy,ego

26,5 średni wiek zahorowania

Parkina (42kDa) jest enzymem E3 (ring type) ligaza ubikwityny, który uczestniczy w znakowaniu ubikwityna bialek przeznaczoanych do degradacji.

Rola parkiny w ochronie neuronów dopaminergicznych (ubikwitynacja czynnika indukującego apoptoze) lub uszkodzona nie wspomaga sprzątani a uszkodzonych białek które zaczynaja tworzyć agregaty.

Okazało się że parkina bierze udział w usuwaniu uszkodzonych mitochondriów (mutacje w mtDNA, stres oksydacyjny, toksyny) może dojśc do śmierci komórki lub tylko do autofagii uszkodzonego mitochondriom

Parkina rozpoznaje uszkodzone mitochondria ze zdepolaryzowaną błona przy pomocy CCCP

CCCP i inne jonofory przerywają sprzeżenie transportu elektronów z fosforylacją- Przenosza protony przez błonę. Transport protonów jezt prawidłowy ale spada energia i nie ma syntezy ATP

Parkina jest niezbędna w trakcie kierowania autofagosomów do uszkodzonych mitochopndrów

Uszkodzone mitochondria znikają z komórek, w których znajduję się parkina

Prawdopodobnie znakowane jest białko PINK1 znajdujące się w błonie mitochondriom co powoduje kierowanie do degradacji

DJ1 (gen park7) aktywność antyoksydacyjną, antyapoptotyczne opiekuńcze i wiążące RNA… Hamuje agregacje alfa-synukleiny brak danych na którym etapie agregacji działa

Występuje w mitochondrium jeśli cysteina 106 zostaje utleniona

LRRK2 (park 8) dardaryna kinaza (ser/thr) zależna od GTP, zdolna do autofosforylacji, oddziaływania z innymi białkami i błonami… jeśli zmutować to wzrasta aktywnośc kinazy, mogą powodowac spadek aktywności GTPazy możliwa intensywna fosforylacji alfa-synukleiny

Szereg białek związanych z chorobą Parkinsona odpowiada za prawidłowe działanie mitochondriów.

Przyczyna niektórych chorób neurodegeneracyjnych może być stres oksydacyjny wywowyany przez

Niedokrwieniem i reperfuzją, Parkinson, Alzheimer, stwardnienie zanikowe boczne (o2- h2o2 oh- no- onoo- tzw. ROS) mogą wywoływać apoptoze lub nekroze

ROS… powstają w mitochondriach w sposób normalny nawet 10% cząstek tlenu z atmosfery, cześć rodników około 2% ucieka z mitochondriów… ale też wydzielane przez fagocyty niszczace bakterie

Trafia się też że podczas metabolizmu tłuszczów ale wiekszosść trafia na katalazy w peroksysomach

Reakcja Fentona Fe2+ H2O2 = woda i HO (nie ma enzymów walczacych z tym rodnikiem)

Glutation, dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza i peroksydaza zabezpieczaja kom przed rodnikami

ROS a Parkinson stwierdzono

Obniżeie poziomu glutationu GSH, wzrost stężenie żelaza (reakcja Fentona) obecnośc peroksydacji lipidów, 8-hydroksyguanozyne produkt oksydacyjnego uszkodzenia DNA

Dopamina ułatwia powstawanie rekatywnych form tlenu, źródłem Fe2+ pochodzi z neuromelaniny (90% komó w istocie czarnej zabarwionych melaniną)

Pirydyna MPTP – powoduje objawy choroby Parkinsona… w astrocytach przekształcana z MPTP do MPP- ( hamowanie oddychania mitochondriów wzrost reaktywnych form tlenu)

Lecznie choroby Parkinsona

Podanie L-DOPY, inhibitory dekarboksylacji DOPA skuteczne na wczesnych etapach leczenia,… inhibitory oksydaz monoaminowej B,… przeciwutleniacze (zwykła witamina C) leczeni chirurgiczne,…

Pochodne leków immunosupresyjne, terapia genowa, przeszczep neuronów, indukcja Hsp

Stwardnienie zanikowe boczne (ALS- amytrophic Lateran sclerosis)

Choroba Lou Gerhiga

-degeneracja neuronów motorycznych w mózgu i rdzeniu

- zmecznei i drżenie mieśni, zwiekszone napięcie mięs, osłabienie kończyn zaburzenia połykania, niewydolnośc oddechowa

- częstość zachorowań 3 na 100 000 wiek 40 -50 śmierć po 2 do 5 lat

Większość przypadków sporadyczna (90-95%)

Około 10% to forma rodzinna (FALS) z tego 20% przypadków zwianych z mutacja w SOD1 kodującym dysmutazę ponadtlenkową CuZnSOD

Wykryto blisko 122 mutacje w genie

CuZnSOD (homodimer 32kDa około 1% białek w komórce) obecna jest w cytozolu jądrze przestrzeni miedzy błonowej mitochondriów komórek eukariotycznych himolog w przestrzeni periplazmatycznej

U człowieka wystepują jeszcze MnSOD (sod2 mitochondria) i SOD (pozakomórkowa)

Modyfikacje potraslancyjne

Wiązanie CU (wymaga białka opiekunczego CCS), wiązanie Zn (metalotioneina) tworzenie mostków SS, dimeryzacja

Mutacje w SOD1: zmiana ładunku białka, brak wiązania jonów metali, destabilizacja struktury… agregacja izolowane z FALS zawierają poza SOD1 ubikwitynę i białka neurofilamentów.

Agregaty w neuronach motorycznych chorych na ALS nie musza zawierać SOD1

Zdaję się iż ani agregaty ani formy pośrednie nie wpływają negatywnie na funkcjonowanie neuronów ale zmniejszenie powinowactwa do ZN destabilizacja struktury powoduje do nieprawidłowej redukcji Cu2+ do Cu+ może wrócic do prawidłowego jonu miedzi jeśli będzie reagowac z O2 ale to powoduje syntezę rodników tlenowych(odwrócenie funkcji)

Rola HSP w FALS

Białka Hsp70 i Hsp27 odanjdywanie w agregatach. Zmitowana SOD1 konkuruje z czynnikiem indukującym apoptoze (AIF) o wiąznie z Hsp70

Terapia

Indukcja syntezy Hsp np. arimoclomol który indukuje syntezę Hsp poprzez stabilizacje czynnika HSF-1 który rozpoznaje operony z Hsp indukując ich syntezę

Aktywność proteasomu która pozwala na usuwanie SOD1 w neuronach rdzenia kregowego spada wraz z wiekiem -> objawy ALS pojawiają się w późnym wieku

Choroba Akexandra

Choroba neurodegeneracyjna wywołana dominujaca mutacja w genie kodującym kwaśne białko włókienkowe gleju – GFAP większość przypadków AXD jest sporadyczna

-leukodystrofia- uszkodzeni istoty białej nieprawidłowea otoczka mielinowa

-wodogłowie

- w astrocytach pojawiają się włókna Rosenthala które zawierają GFAP wimentye, ubikwitynę alfaB-krystaline i Hsp27

Objawy pojawiaja się już u noworodków np. padaczka i szybka śmierć przed 2 rokiem życia

… mogą tez pojawic się w okolicach 6 miesiaca życia makrocefalia niedorozwój umysłowy

U rodosłych podoben do stawtnienai rozsianego

GFAP jest markerem astrocytów… komórki glejowe wspomagają komórki nerwowe jest ich 10x wiecje niż neuronów, astrocyty są najliczniejsze zapobiejaga dyfuzji neuroprzkazników poza szczeline, transport glukozy

GFAP – należy do fi lamentów pośrednich obecne przedewszytkim w astrocytach centralnego i obwodowego układu nerwowego (włókna rozentala tylko w ośrodkowym)

Włókna Rozenthala często wokół naczyń krwionośnych

Zmutowane GFAP powoduje uszkodznie cytoszkieltu

Brak alfaB-krystaliny nie powoduje powstawanie włókien Rosenthala ale znacznie obniża przeżywalność, natomiast nadprodukcja alfaB-krystaliny spowania powstawanie włókien i wydłuża czas życia, okazłąo się też że obecność alfaB-krystaliny hamuje stresową w centralnym układzie nerwowym

Składnieki włókien Rozenthala są poza GFAP i sHsp jest też plektyna (która zapobiega agregacji GFAP) plektyna białko łącznikowe w cytoszkielecie

Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Zagadnienia konformacje białek
Przykłady roli biologicznej białek
Właściwości fizykochemiczne białek
1 Przyswajanie białek przez organizmid 8658 ppt
właściwości białek mięśniowych
Budowa Chemiczna Białek
Funkcje białek, Biochemia
6 - Znaczenie konformizmu w systemie kontroli spol. sms, zchomikowane, 35 000 edukacyjnych plikó
19.Budowa białek, Notatki AWF, Biochemia
konformizm, Pedagogika, Psychologia społeczna
Amoniak można oznaczyć z krwi i moczu produkt rozkładu białek
Projektowanie nowych białek o zadanych właściwościach katalitycznych
TORT Z BIAŁEK
konformistami, Psychologia
12. Metody oczyszczania białek (1), Biotechnologia w Ochronie Środowiska
Konspekt trawienie białek, tłuszczów i węglowodanów
Metody badania białek, Materiały - Biotechnologia

więcej podobnych podstron

Konformacje białek

Wykład 1

Wykład 2