Ćwiczenia 04-06
MAPOWANIE CHROMOSOMÓW METODĄ KRZYŻÓWEK 2- I 3-PUNKTOWYCH.
Ustalenie położenia genów odpowiedzialnych za powstawanie określonej barwy konidiów oraz za syntezę białek zaangażowanych w biosyntezę adeniny, proliny, fenyloalaniny oraz kwasu paraaminobenzoesowego na chromosomach Aspergillus nidulans.
Dołączone materiały:
Krzyżówki haploidalnych grzybów jako model do badania przebiegu procesu crossing-over przy tworzeniu gamet.
Cykl życiowy Aspergillus nidulans (rys. 1).
Konstrukcja mapy genetycznej Aspergillus nidulans na podstawie krzyżówek 2-punktowych (rys.2).
Konstrukcja mapy genetycznej Aspergillus nidulans na podstawie krzyżówek 3-punktowych (rys.3).
Test niezależności chi-kwadrat.
Materiały:
Szczepy Aspergillus nidulans:
a) z konidiami koloru zielonego, niezdolny do syntezy kw. paraaminobenzoesowego (Y, paba-)
b) z konidiami koloru żółtego , niezdolny do syntezy adeniny, proliny i fenyloalaniny (y, ad-, pro-, phe-).
Podłoża:
a) minimalne stałe dla Aspergillus:
NaNO3 - 6,0 g
MgSO4 x 7H2O - 0,52 g
KCl - 0,52 g
KH2PO4 - ślady
FeSO4 - ślady
Agar - 15,0 g
H2O dest. - 1000 ml
Glukoza - 0,2% dodać jałowo przed rozlaniem płytek.
b) pełne płynne dla Aspergillus:
Pepton - 1,0 g
Wyciąg drożdżowy - 1,0 g
NaNO3 - 6,0 g
KH2PO4 - 1,5 g
MgSO4 - 0,5 g
KCl - 0,5 g
Hydroliza kazeiny - 1,0 g
H2O dest. - 1000 ml
Glukoza - 10,0 g
c) pełne stałe dla Aspergillus:
Agar minimalny wzbogacony o odpowiednie ilości aminokwasów, witamin i zasad dla obu mutantów.
Roztwory wodne składników wzbogacających podłoże minimalne:
Wykonanie:
1. Krzyżowanie szczepów
Wysiać obie grzybnie (osobno) na pełne skosy agarowe na 7 dni przed krzyżowaniem. Przygotować 1 płytkę z podłożem minimalnym, na którą wsiać obficie wzdłuż średnicy płytki oba szczepy grzyba. Pomieszać obie grzybnie ezą, wklepać w agar wzdłuż wykonanej rysy i skropić pełnym podłożem płynnym. Wstawić do termostatu 37°C na 14 dni, w czasie których zachodzi krzyżowanie i tworzenie grzybni heterokariotycznej, produkującej askospory (powinna wyrosnąć grzybnia: część wegetatywna biała z konidiami zielonymi i żółtymi).
2. Izolacja zarodników
Wewnątrz grzybni wegetatywnej powinny pojawić się widoczne pod binokularem czarne lub ciemnobrązowe peritecja, które należy wyizolować, wybierając najbardziej dojrzałe (jak największe i najciemniejsze). Oczyścić ze strzępków grzybni wegetatywnej, przenieść do 2 ml wody destylowanej i jałowo rozgnieść uwalniając askospory (kolor czerwony). Otrzymaną zawiesinę askospor rozcieńczyć 10-1, 10-2, 10-3 i wysiać na kilka płytek z podłożem pełnym (po 0,1 ml). Płytki inkubować 3-4 dni w 37°C.
3. Wybrać 100 kolonii (50 żółtych i 50 zielonych), każdą z nich wysiać na szereg płytek (patrz tabela poniżej) w celu określenia ich zdolności do syntezy paba, ad, pro i phe.
Na płytkę wysiewać po 25 kolonii wg poniższego wzoru:
Płytki umieścić na 2-3 dni w 37°C, po czym odczytać wynik i umieścić go w tabeli (wzór poniżej), stosując symbole: „+” dla wzrostu oraz „-” dla braku wzrostu. Oznaczenie typu „paba” jest równoznaczne z: „płytka z podłożem minimalnym wzbogaconym w ad, pro i phe, lecz pozbawionym paba” itd. Odczytać fenotyp i genotyp poszczególnych kolonii.
Zadania:
Policzyć i zidentyfikować ilość osobników w poszczególnych grupach.
Na podstawie liczebności grup fenotypowych (i genotypowych) określić:
a) odległości pomiędzy poszczególnymi genami (% rekombinacji) i kolejność genów na chromosomie,
b) czy i które geny są sprzężone ze sobą, a które dziedziczą się niezależnie.
Aspergillus nidulans (Emericella nidulans) jest grzybem nitkowatym, workowcem (Ascomycetes). Został wybrany jako obiekt badań genetycznych w latach 40-tych, m.in. ze względu na łatwą selekcję dużej liczby mutantów oraz dzięki obserwowanemu w laboratorium cyklowi płciowemu, który umożliwia prowadzenie badań nad rekombinacją mejotyczną. Dodatkowo, okazał się bardzo dogodnym organizmem do badań nad rekombinacją mitotyczną (somatyczną), której odkrycie pomogło w badaniach genetycznych u wyższych Eukaryota. Obecnie różne gatunki Aspergillus mają duże znaczenie w biotechnologii (np. Aspergillus niger) i w medycynie (często są patogenami, np. Aspergillus fumigatus) oraz nadal są wykorzystywane jako organizmy do badań podstawowych.
Cykl życiowy.
A. nidulans jest organizmem haploidalnym, posiada genom o wielkości ~ 31 Mb, zorganizowany w 8 chromosomach. Znana jest sekwencja całego genomu tego grzyba: (www.broad.mit.edu/annotation/fungi/aspergillus).
Strzępki grzybni są przedzielone poprzecznymi przegrodami (septa) na segmenty zawierające jedno jądro. Przegrody są jednak perforowane i dlatego A. nidulans jest fizjologicznie komórczakiem. W warunkach naturalnych A. nidulans rozmnaża się wegetatywnie, wytwarza konidiofory produkujące jednojądrowe haploidalne konidia. Jego grzybnia może tworzyć tzw. heterokariony, powstające po połączeniu haploidalnych grzybni dwóch szczepów. W grzybni heterokarionu występują dwa typy genetycznie różnych jąder haploidalnych. Heterokarion wytwarza również jednojądrowe, haploidalne konidia. W warunkach laboratoryjnych, można ten organizm zmusić do rozmnażania w sposób płciowy. A. nidulans jest homotalliczny, tzn. nie występują różne typy płciowe grzybni, w odróżnieniu od np. heterotalliczynych drożdży czy Neurospora crassa. W procesie rozmnażania płciowego w niciach workotwórczych dochodzi do utworzenia par jąder sprzężonych, a następnie w komórkach workotwórczych do faktycznego zlania się jąder haploidalnych (kariogamii) i wytworzenia diploidalnego jądra (komórka macierzysta askospor). Dwa podziały mejotyczne tego jądra i następująca po nich mitoza prowadzą do wytworzenia worków, zawierających po 8 askospor. W czasie różnicowania askospor dochodzi do jeszcze jednego podziału mitotycznego wewnątrz askospory i dlatego każda askospora zawiera dwa haploidalne jądra identyczne genetycznie. Proces ten zachodzi w klejstotecjach (ciałach owocujących) wypełnionych tysiącami worków. Z askospor wyrasta homokariotyczna grzybnia haploidalna. Bardzo rzadko podczas rozmnażania wegetatywnego może dojść do spontanicznego powstania konidium diploidalnego. Takie diploidalne konidium daje początek diploidalnej grzybni. Traktowanie takiej diploidalnej grzybni czynnikami anty-tubulinowymi (np. benomylem) prowadzi do haploidyzacji. Jest to tzw. cykl paraseksualny (przejście od stadium diploidalnego do haploidalnego następuje bez mejozy).
Analiza sprzężeń.
Analiza fenotypu kiełkującej z askospor grzybni pozwala np. na badanie sprzężeń między genami - poprzez obserwację częstości powstawania rekombinantów. Jak wspomniano wyżej, aby założyć krzyżówkę trzeba zmusić różne genetycznie grzybnie do wytworzenia heterokarionu, a następnie wejścia w cykl płciowy. Osiąga się to szczepiąc konidia różniących się wymaganiami pokarmowymi szczepów na pożywce pozbawionej część uzupełnień. Jedynie utworzony heterokarion może rosnąć w tych warunkach Warunki beztlenowe i uboga pożywka „wymuszają” tworzenie klejstotecjów i powstanie askospor. W pracy z A. nidulans, m. in. przy zakładaniu krzyżówek, pomaga barwa konidiów. Znane są trzy podstawowe barwy, zależnie od mutacji w odpowiednich genach szlaku biosyntezy barwnika: zielona (kolor dziki, przy czym w zapisie fenotypu szczepu pomija się jej oznaczenie), żółta (y) i biała (w).
krzyżówka 2-punktowa
krzyżówka 3-punktowa