Malwina Hut
nr indeksu: 121268
Zastosowanie myszy szczepu Foxn1nu jako modelu zwierzęcego w badaniach naukowych
1.Opis modelu
NU/J to myszy z niedoborem odporności pochodzące z National Institute of Health i oryginalnie uważana za kongeniczny szczep BALB/c. Dopiero później określono, że nie są wsobne i utrzymywano je jako niekrewniacze. Nie są powiązane z żadnym stadem czy szczepem. Szczep został otrzymany po raz pierwszy przez Dr. N.R.Grist w Laboratorium wirusologicznym szpitala Ruchill w Glasgow. Brak grasicy powoduje, że nie wytwarzają komórek T oraz wykazują częściowe wady w rozwoju limfocytów B, prawdopodobnie ze względu na brak funkcjonalnych limfocytów T i dlatego są immunoniekompetentne. Hodowane przez Charles River od 2010 r. Myszy szczepu NU/J występują w 2 homozygotycznych odmianach: Foxn1nu oraz Hfh11nu. Są to osobniki nagie z zaburzeniami rozwoju włosów co związane jest z uszkodzonymi mieszkami włosowymi oraz atymiczne.1
2. Wykorzystanie modelu myszy szczepu Foxn1nu w badaniach naukowych.
2.1 Użycie szczepu NU/J Foxn1 jako mysiego modelu malformacji tętniczo-żylnej (AVM).
Malformacje tętniczo-żylne (AVM) są ogniskami nieprawidłowo poszerzonych tętnic i żył mózgowia, charakteryzujących się utratą prawidłowej organizacji naczyń drobniejszych niż tętniczki i brakiem łożyska naczyń kapilarnych, skutkującym przeciekiem tętniczo-żylnym. AVM mogą występować w każdym miejscu ośrodkowego układu nerwowego. Małe tętnice wchodzące w skład AVM nie posiadają warstwy mięśni gładkich. Nieprawidłowe naczynia tętnicze i żylne w kłębku, są połączone przetoką, lub, częściej, wieloma przetokami. Bezpośrednie połączenie naczyń tętniczych i żylnych sprawia, że gradient ciśnienia między nimi jest bardzo wysoki; ścieńczenie ściany żył zwiększa ryzyko ich pęknięcia, którego skutki mogą być śmiertelne. 2
Patogeneza AVM jest niejasna, a wszystkie dotychczasowe modele zwierzęce dotyczące tej choroby są niezadowalające. W pracy N.Paladino „Characterization of locomotor activity circadian rhythms in athymic nude mice” 3 użyto mysiego modelu szczepu Foxn1nu w celu odkrycia patogenezy oraz sposobów leczenia tej choroby.
W artykule tym 5 żeńskich 6-8 tygodniowych osobników myszy szczepu Foxn1nu zakupionych w Harlan Laboratories uśpiono za pomocą mieszaniny hydrochlorku ketaminy, hydrochlorku ksylazyny i PBS w stosunku 1:1:2,3 (dawka 40mg/ mL). Następnie wszczepiono im podskórnie świeże próbki AVM pobrane od 4 różnych, zdiagnozowanych wcześniej pacjentów. Przeszczepy ksenograficzne wszczepiono w 4 osobne pola na plecach każdej z myszy. Myszy po przeszczepie obserwowano i fotografowano. Notowano kolor, teksturę, wielkość przyjętego przeszczepu. Kolejno po 30, 60, 90 i 120 dniach usuwano przeszczepy po uprzednim znieczuleniu myszy, a następnie poddano je dalszej analizie histologicznej. Po usunięciu przeszczepu, każda mysz została w sposób humanitarny zabita.
Dzięki przeprowadzonemu badaniu wykazano, że ludzki przeszczep AVM może przetrwać w nagich myszach Foxn1. Poszukiwanie markerów AVM zaowocowały wytypowaniem markera VEGFR-2. Zaobserwowano także pojawienie się Ki-67, który jest markerem związanym z proliferacją komórek. Jego obecność powiązana była z faza wzrostu naczyniaków, które zaobserwowano u myszy szczepu Foxn1nu 30-40 dni po przeszczepie ksenograficznym. Proliferacja komórek przeszczepu nastąpiła po transplantacji, co jest zgodne z poglądami, że AVM często same z siebie nie dają objawów. Objawy są najczęściej wywołane operacjami, urazami czy zmianami hormonalnymi, co powoduje ich szybki rozwój. Istotną wadą tego badania jest jego krótki czas, ponieważ naczyniaki rosną bardzo powoli. Model ten nie odzwierciedla wszystkich cech ludzkiego AVM, ale badanie to pokazuje po raz pierwszy, że ludzkie AVM mogą przetrwać w nagich myszach w postaci niezmienionej. W modelu tym zmiany przeszczepu można zaobserwować gołym okiem. Mysi model AVM może być przedmiotem dalszych badań nad patogenezą i leczeniem malformacji tętniczo-żylnych.
2.2 Zastosowanie szczepu Foxn1nu jako nowego modelu w badaniach dotyczących raka szyjki macicy i raka odbytu wywoływanych przez wirus brodawczaka ludzkiego (HPV).
HPV jest to wirus brodawczaka ludzkiego z rodziny papillomawirusów. Istnieje około 100 typów tego wirusa, z których część może być przyczyną łagodnych zmian w postaci brodawek na skórze, część powstawania łagodnych zmian w postaci kłykcin kończystych, a część nowotworów złośliwych jak rak szyjki macicy i rak prącia. 4
Zakażenia wirusem brodawczaka i nowotwory przez nie rozwijające się są dużym problemem w dzisiejszych czasach. Rak szyjki macicy, który prawie zawsze wiąże się z dużym ryzykiem (HPV wirusa brodawczaka ludzkiego), jest główną przyczyną śmierci kobiet w wieku rozrodczym w krajach rozwijających się. Inne nowotwory związane z wirusem Papilloma to nowotwory głowy i szyi oraz rak odbytu. Dostępne na rynku szczepionki Gardasil i Cervarix , są drogie i trudnodostępne dla zakażonych wirusem. Papilloma jest specyficzny gatunkowo i badanie szczepów powodujących infekcje u ludzi jest nieefektywne w zwierzęcych modelach. Właściwy model zwierzęcy dotyczący HPV jest poszukiwany od dawna.
W artykule Nancy M.„A Novel Pre-Clinical Murine Model to Study the Life Cycle and Progression of Cervical and Anal Papillomavirus Infections” 5 sprawdzono, czy nowoodkryty mysi szczep wirusa HPV MmuPV1 jest w stanie zainfekować tkanki błony śluzowej myszy szczepu Foxn1nu. Badanie to wykazało po raz pierwszy, ze wirus HPV wykazuje podwójny tropizm tkankowy i otworzyło drogę do pierwszego zastosowania małego zwierzęcego modelu w badaniach nad wirusem brodawczaka w tkankach odbytu i narządów płciowych.
W badaniu opisanym w artykule myszy Foxn1nu uzyskane z Harlan Laboratories trzymano w sterylnych klatkach, zapewniając im nieograniczony dostęp do wody i pożywienia.
2.2.1. Zakażenie dopochwowe
W 13 dniu doświadczenia myszom podano podskórnie 3 mg progesteronu w postaci rozpuszczonego w 100 µl PBS w celu ułatwienia zakażenia wirusem. Trzy dni po podaniu progesteronu zaaplikowano myszom dootrzewnowo środki uspokajające: (0,1 ml / 10g masy ciała) ketaminę i ksylazynę (100 mg / 10 mg w 10mls PBS). Następnie specjalnymi stomatologicznymi, tępo zakończonymi patyczkami wprowadzono do pochw myszy Conceptrol. 24 godziny później myszy ponownie znieczulono. Do pochw zwierząt przeniesiono pipetą 2 x po 25 ul zawiesiny wirusowej. Całkowita ilość wirusów wprowadzonych 1 myszy wynosiło 6 x 108 cząstek wirusa na mysz. Zwierzęta umieszczono na plecach, aby zminimalizować straty wirusa. Po zabiegu każdą mysz monitorowano i fotografowano.
2.2.2. Zakażenie doodbytnicze
Myszom w wieku 12 tygodni zaaplikowano dootrzewnowo środki uspokajające: (0,1 ml / 10g masy ciała) ketaminę i ksylazynę (100 mg / 10 mg w 10mls PBS).Następnie specjalnymi stomatologicznymi, tępo zakończonymi patyczkami wprowadzono do odbytów myszy Conceptrol. 24 godziny później myszy ponownie uśpiono. Do odbytów zwierząt przeniesiono pipetą po 10 ul zawiesiny wirusowej. Całkowita ilość wirusów wprowadzonych do 1 myszy wynosiło 1.4x108 cząstek wirusa na mysz. Po zabiegu każdą mysz monitorowano i fotografowano.
2.2.3. Pobranie próbek
Myszy uśmiercono w tygodniach 9, 14, 25 i 30 po zainfekowaniu. Po wykonaniu eutanazji próbki nabłonka pochwy oraz odbytu poddano analizie histologicznej oraz hybrydyzacji.
Zakażenie myszy mysim szczepem wirusa HPV MmuPV1 zakończyło się sukcesem. Badania histologiczne u myszy poddawanych eutanazji po 9, 14, 25 i 30 tygodniach po zakażeniu wykazały szereg zmian w nabłonkach odbytu i pochwy wskazujących na toczącą się infekcję. Zaobserwowano także dysplazję nabłonków. Nie zaobserwowano nowotworzenia, gdyż czas trwania eksperymentu był zbyt krótki. Myszy szczepu Foxn1nu można z powodzeniem stosować w badaniach nad nowotworami związanymi z zakażeniem wirusem brodawczaka. Model ten może być także stosowany do badań nad chorobami utajonym, co ma istotne znaczenie w czasach, gdy wzrosła liczba osób z osłabionym układem odpornościowym u których występuje znaczne zaostrzenie infekcji wirusem brodawczaka.
2.3 Zastosowanie szczepu Foxn1nu jako mysiego modelu w nowotworze nadnerczy wywołanym gonadektomią.
Rak nadnercza jest rzadkim nowotworem złośliwym wywodzącym się z kory nadnerczy. Główne czynniki etiologiczne tego nowotworu nie są do końca znane. Przypuszcza się, że wpływ na rozwój guza mają hormony płciowe. Aby potwierdzić te przypuszczenia, wykorzystano myszy szczepu Foxn1nu jako modelu nowotworu nadnerczy indukowanym gonadektomią. 6
Praca M.Bielińskiej „Gonadotropin-inducted Adrenocortical neoplasia in NU/J nude mice” 7 dotyczy myszy szczepu Foxn1nu,które zakupiono w Jackson Laboratory i trzymano w specyficznych, wolnych od patogenów warunkach. Osobniki zamieszkiwały klatki w ilości 5 sztuk na klatkę, w warunkach kontrolowanych (rytm dobowy 12 h dzień/12 h noc, temperatura 21°, nieograniczony dostęp do wody i pożywienia).
3-4 tygodniowe samice zostały uśpione poprzez dootrzewnowe podanie mieszaniny ketaminy, ksylazyny i acepromazyny, a następnie poddane gonadektomii lub fikcyjnej operacji. Natychmiast po gonadektomii myszom wstrzyknięto podskórnie w każdy bok po 0,2 ml wcześniej przegotowanej mieszaniny zawierającej komórki jajnikowe pobrane od chomika chińskiego wydzielające gonadotropinę kosmówkową, hodowane na pożywce uzupełnionej antybiotykami. W określonym czasie myszy zostały zabite przez inhalację CO2, a następnie pobrano im próbki krwi aby zmierzyć stężenie hormonów takich jak LH, hCG, testosteron, estradiol, kortykosteron, oraz tkanek w celu przeprowadzenia badań histologicznych, hybrydyzacji i RT-PCR.
U nagich myszy poddanych gonadektomii lub heteroprzeszczepowi komórek wydzielających hCG w ciągu kilku tygodni od zabiegu potwierdzono zmiany w gruczołach nadnerczowych, co sugeruje, że przewlekłe wzniesienie gonadotropin jest główny sygnał odpowiedzialny w tym przypadku za proces nowotworzenia. Po 4 miesiącach od zabiegu guz zajmował już dużą część kory nadnerczy. Wykazano więc, że osobniki z zaburzeniami produkcji hormonów płciowych mogą być predysponowane do występowania u nich nowotworów nadnerczy wywołanych gonadektomią. Ponadto wykazano infiltrację komórek tucznych w tkance nowotworowej. Zastosowany model daje wgląd w mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju nowotworów nadnerczy.
3. Podsumowanie
Myszy szczepu Foxn1nu są uniwersalnym, a za razem najczęściej wybieranym modelem zwierzęcym do badań skupiających się na biologii nowotworów. Ze względu na uszkodzone mieszki włosowe mogą być przydatnym modelem w badaniach dotyczących schorzeń dermatologicznych. Z powodu braku limfocytów T oraz niedoborze limfocytów B mogą służyć jako dobry model w chorobach immunologicznych związanych z brakiem odporności, a także w badaniach dotyczących przeszczepów ksenograficznych. Dodatkowo korzystanie z myszy szczepu Foxn1nu umożliwiło redukcję ilości wykonywanych tymektomii w innych mysich modelach.