Czynniki warunkujące aktywność enzymów na przykładzie fosfatazy kwaśnej.

Wykonanie:

Celem ćwiczenia jest wykazanie na przykładzie fosfatazy kwaśnej, że czynniki takie jak stężenie enzymu, temperatura, stężenie jonów wodorowych (pH) oraz inhibitory wpływają na szybkość reakcji enzymatycznych.

Część I:

Wpływ stężenia enzymu na szybkość przebiegu reakcji

Do pięciu ponumerowanych probówek odmierzamy kolejno po 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 ml roztworu enzymu (ekstrakt z 10-dniowych siewek pszenżyta i 100 ml wody destylowanej homogenizowany przez 5 minut i przesączony przez sączek z waty), po 0,75 ml buforu cytrynianowego o pH 5,2, a następnie uzupełniamy wodą destylowaną do objętości 2 ml. Do probówki nr 6 odmierzamy 0,75 ml buforu cytrynianowego o pH 5,2 i 1,25 ml wody destylowanej. Będzie to nasza próba kontrolna. Wszystkie probówki umieszczamy na 5 min
(preinkubacja) w łaźni wodnej o temperaturze . Po preinkubacji, nie wyjmując prób z łaźni wodnej, dodajemy kolejno do wszystkich probówek po 0,5 ml roztworu substratu (nitrofenylofosforanu disodowego), mieszamy i inkubujemy w łaźni jeszcze przez 15 minut. Po tym czasie dodajemy 2,5 ml węglanu sodowego i mierzymy absorbancję prób właściwych w spektrofotometrze przy długości fali 420 nm ustawionym na zero wobec próby kontrolnej.

Część II:

Wpływ pH na szybkość reakcji enzymatycznych

Do czterech kolejno ponumerowanych probówek odmierzamy po 0,5 ml enzymu, dodajemy po 0,75 ml wody destylowanej oraz po 0,75 ml buforów kolejno o pH 3,0; 4,4; 5,2; 6,0. Wszystkie probówki umieszczamy w łaźni wodnej w temperaturze na 5 minut. Po tym okresie preinkubacji, nie wyjmując prób z łaźni dodajemy do wszystkich po 0,5 ml roztworu substratu, mieszamy i inkubujemy jeszcze przez 15 minut. Po tym czasie dodajemy 2,5 ml węglanu sodowego i mierzymy absorbancję dla prób w fotometrze.

Część III:

Wpływ temperatury na aktywność enzymów

Do czterech kolejno ponumerowanych probówek odmierzamy po 0,5 ml ekstraktu enzymatycznego, a następnie pierwszą umieszczamy w łaźni wodnej o temperaturze , drugą w łaźni o temperaturze , trzecią w , a czwartą w . Inkubujemy przez 30 minut. Następnie wszystkie probówki po schłodzeniu umieszczamy w łaźni o temperaturze przez 5 minut. Po tym czasie dodajemy po 0,75 ml buforu cytrynianowego o pH 5,2 oraz po 0,75 ml wody destylowanej i po 0,5 ml substratu i inkubujemy przez 15 minut. Później dodajemy do wszystkich probówek po 2,5 ml 10% węglanu sodowego i mierzymy absorbancję.

Część IV:

Inhibicja aktywności enzymów

Do dwóch ponumerowanych probówek odmierzamy po 0,5 ml enzymu, po 0,75 ml buforu cytrynianowego. Następnie do 1. probówki dodajemy 0,25 ml molibdenianu amonu. Zawartość probówki pierwszej i drugiej uzupełniamy wodą destylowaną do objętośći 2 ml. Do probówki trzeciej dodajemy 0,75 ml buforu cytrynianowego o pH 5,2 oraz 1,25 ml wody destylowanej (próba kontrolna). Próby wstawiamy do łaźni wodnej o temperaturze na 5 minut, a następnie nie wyjmując prób z łaźni, do wszystkich dodajemy po 0,5 ml substratu, mieszamy i inkubujemy przez 15 minut. Przerywamy reakcję dodając po 2,5 ml węglanu sodowego i mierzymy absorbancję dla prób w fotometrze o długości fali 420 nm.

Wyniki i obliczenia:

Z powodu niedokładności większości wyników wybrałyśmy wartości absorbancji dla:

stężenia enzymu równego 0,5 ml – wartość absorbancji – 0,233 (A)

buforu o wartości pH 5,2 ml – wartość absorbancji – 0,235 (B)

enzymu bez inhibitora – wartość absorbancji – 0,253 (C)

Przy pomocy tych wartości obliczamy szybkość reakcji wyrażając ją jako ilość μmoli uwolnionego w reakcji p-nitrofenolu w czasie 1 min:

A: 0,233 / 0,002 x 139 x 10 min = 0,0838

0,002 – współczynnik absorbancji dla 1 μg p-nitrofenolu

139 – masa molowa p-nitrofenolu

10 min – czas reakcji

B: 0,235 / 0,002 x 139 x 10 min = 0,0845

C: 0,253 / 0,002 x 139 x 10 min = 0,091

Wyniki absorbancji dla poszczególnych wartości stężenia enzymu:

Stężenie enzymu [ml]	A
0,25	0,123
0,5	0,233
0,75	0,318
1,0	0,358
1,25	0,516

<o ile to jeszcze dobrze wygląda to pH to masakra, no i nie mamy temperatury, więc albo ją pomijamy albo bierzemy od kogoś, nie wiem, zrób research w tej kwestii :D>

Wyniki absorbancji dla poszczególnych wartości pH:

Wartość pH	A
3,0	0,108
4,4	0,111
5,2	0,235
6,0	0,073

<pkt 3 w opracowaniu wyników mówi, że jednak potrzebna jest temperatura, więc chyba trzeba od kogoś zakosić odpowiednie ładnie wyniki, może od Panasa albo od Klaudii? :D>

Porównanie aktywności fosfatazy kwaśnej w reakcji bez inhibitora (2.) oraz z inhibitorem (1.).

1. 0,253

2. 0,183

Aktywność bez inhibitora to powyższy punkt C, który wynosi 0,091 μmola/min.

Aktywność z inhibitorem:

0,183 / 0,002 x 139 x 10 min = 0,066 μmola/min

0,066 / 0,091 * 100% = 72,52 % otrzymanego produktu, czyli szybkość została zahamowana w 27,48%. ?????

Wnioski :

Im wyższe stężenie enzymu tym szybkość reakcji rośnie.

Im bliżej wartości optymalnego pH tym szybkość reakcji rośnie, później spada.

Im wyższa temperatura….

Inhibitor obniża szybkość reakcji, bez inhibitora reakcja zachodzi dużo szybciej.