21.05.2009

SPRAWOZDANIE

Katarzyna Piaskowy

Biotechnologia, Chem 2

Ćwiczenie nr 5

Temat: Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

Wstęp teoretyczny:

PCR to reakcja łańcuchowa polimerazy. Służy do powielenia danej sekwencji, aby np. w razie zniszczenia jednej próbki DNA mieć w zapasie inne. Polega ona na działaniu polimerazy, która dzięki starterom dobudowywuje komplementarną (nowa nić na rys. oznaczona czarną linią) do wcześniej rozdzielonej nici. Primery -krótkie sekwencje DNA, które przyczepiają się do nici DNA rozpoczynając jej polimeryzację (na rysunku oznaczone różowymi lub niebieskimi strzałkami), bez nich polimeraza nie mogłaby zacząć reakcji (muszą być odpowiednio dobrane ze względu na ilość, rodzaj zasad, powtórzenia, temperaturę topnienia). Do rekcji konieczna jest matryca DNA.

PCR można podzielić na 3 etapy:

• Denaturację podwójnej nici DNA

• Przyłączenie starterów (jednocześnie jest obniżana temperatura reakcji)

• Synteza/wydłużanie łańcucha (podwyższenie temperatury w stosunku do wcześniejszego etapu)

Temperatura ma duży wpływ na przebieg reakcji, zarówno zbyt wysoka i za niska temperatura zmniejszają wydajność lub dokładność reakcji.

Sekwencja jest powielana w sposób wykładniczy.

Ćwiczenie 1:

Mając do dyspozycji:

H₂O dejonizowana

Bufor do PCR II (Perkin Elmer) 10 x

MgCl₂

dNTPs (mieszanina)

starter F 25 pM/μl

starter R 25 pM/μl

polimeraza Taq 1 U/μl

DNA komórkowe 50 ng/μl

Musiałyśmy otrzymać następujące stężenia substratów:

Bufor do PCR II (Perkin Elmer) 1 x

MgCl₂ w stężeniu

dNTPs (mieszanina) w stężeniu 200 μM

starter F 50 pM

starter R 50 pM

DNA komórkowe 100 ng

Polimeraza Taq 2 U

H₂O dejonizowana

Objętość końcowa: 50 μl

Wykonałyśmy następujące obliczenia:

Potrzebna ilość buforu do PCR II:

Z buforu 10x stężonego ↔1 raz stężony

50/10=5 μl

MgCl₂:

25 mM ↔50 μM

1,5 mM↔x

X=3 μl

dNTPs:

(5 mM) 5000 μM↔50 μl

200μM↔x

X=2 μl

Starter F:

25 pM↔1 μl

50 pM↔x

X= 2 μl

Starter R:

25 pM↔1 μl

50 pM↔x

X= 2 μl

DNA komórkowe:

50 ng↔1 μl

100ng↔x

X=2 μl

Polimeraza Taq:

1U↔1μl

2U↔x

X=2μl

H₂O dejonizowana:

50-(5+3+2+2+2+2+2)=50-18=32 μl

Zmieszałyśmy wyliczone objętości w kolejności:

1. H₂O dejonizowana

2. Bufor do PCR II (Perkin Elmer)

3. MgCl₂

4. dNTPs

5. starter F

6. starter R

7. DNA komórkowe

8. Polimeraza Taq

Po dodaniu kolejnych produktów mieszałyśmy za pomocą pipety, a próbki odstawiałyśmy do pojemnika z lodem.

Następnie próbkę zwortex’owałyśmy około 20 s oraz wstawiłyśmy do wirówki na 2 minuty.

Przełożyłyśmy 25 μl do paska zawierającego zestaw próbówek i odstawiłyśmy do termocyklera.

Ustawiono termocykler wg wskazówek podanych w instrukcji:

1. Denaturacja pierwsza 10 min.

2. cykl 1

   1. Denaturacja 94⁰C, 30 sek.

   2. Annealing 64⁰C, 30 sek.

   3. Elongacja 72⁰C, 1 min.

3. 35 cykli

4. Elongacja końcowa 72⁰C, 10 min.

5. Koniec 4⁰C

Po zakończeniu reakcji próbki zostały rozdzielone w żelu agarozowym.

Niestety nasza sekcja nie otrzymała oczekiwanych produktów.

Ćwiczenie 2:

Mając sekwencje eksonów szczurzego genu mtTFA, obliczałyśmy T_m dla poszczególnych starterów:

T_m = 2(N_A+N_T) + 4(N_G+N_C),

N_A – ilość nukleotydów adeninowych,

N_T - ilość nukleotydów tymidynowych,

N_G – ilość nukleotydów guaninowych,

N_C – ilość nukleotydów cytozynowych,

1. ATTACCCAAGCTGGAAAAACACTT

T_m=66 ^oC

1. GAGTACCCACGCGGGTTTCG

T_m=66 ^oC

1. TGTATTCCGAAGTGTTTTTCCAGCTT

T_m=72 ^oC

1. TGTGCCCAATCCCAATGACA

T_m=60 ⁰C

Różnica między temperaturami topnienia starterów nie powinna być duża (do 5 ^oC), dlatego najlepiej dopasowane startery to te które mają identyczną T_m czyli 1 i 2.

GGCATGATAACAAGCCCCTGGAGTACCCACGCGGGTTTCGTGGCTGTGTGTAGGCACAGTGTCGCGTGGGACGAACCGGACGGCGCCGGGCCTATAGTCGTCGGCCCGAGGGATGGCGCTGTTCCGGGGAATGTGGGGCGTGCTAAGAACACTGGGGCGCACGGGGGTCGAGATGTGCGCGGGCTGCGGGGGCCGCATACCCTCGCCTGTCAG

CCTTATCTGTATTCCGAAGTGTTTTTCCAGCTTGGGTAATTATCCAAAGAAACCTATGAGTTCATACCTTCGATTTTCTACAGAACAGCTACCCAAATTTAAAGCTAAACACCCAGATGCAAAAGTTTCAGAACTGATTAGAAAAATTGCAGCCATGTGGAGGGAGCTTCCGGAAGCAGAAAAAAAGGTGTATGAAGCGGATTTTAAAGCTGAGTGGAAGGTGTACAAAGAAGCTGTGAGCAAGTATAAAGAGCAGCTAACTCCAAGTCAGCTGATGGGCTTAGAGAAGGAAGCCCGGCAGAAACGCCTAAAGAAGAAAGCACAAATCAAGAGGAGAGAATTAATTTTGCTTGGAAAACCAAAAAGACCTCGGTCAGCATATAACATTTACGTATCTGAAAGCTTCCAGGAGGCTAAGGATGAGTCAGCTCAGGGGAAATTGAAGCTTGTAAATCAGGCTTGGAAAAATCTGTCTCATGATGAAAAGCAGGCATATATTCAGCTTGCTAAAGATGATAGAATTCGTTATGACAATGAAATGAAGTCTTGGGAAGAGCAAATGGCTGAAGTTGGGCGAAGTGATCTCATCCGTCGCAGTGTGAAGCGACCCCCGGGAGACATCTCTGAGAATTAAGATTGAAGACAGAGTTGTCATTGGGATTGGGCACAA

GAAGCTGGTTAAGTCTCAAAGCCTTAAGTTGTCAAACTTGAAAGGATAAAGGGGTTAACCTTTGACACTCAGTTCATTTTTCTGTAGCCCATGGACTTCTGCCCACTGAATGCATTTCTGTTGACCTTTTGAGCCTTGACAGTAGATCATGACGAGTTCTGCCGTTTGCTTAAGAACTGGAATCAAGACTGTGCGTGCATCTGCATGCAGTGGTGAATTGTTCTGCATTTGATGGTGTAGACAGACTGAAGTGACTTTCACACTGGTGACAGTTTCGTGCGGGTTTGTGAAGTTCTTACACTGATGGCCATTACATGTGGGTGCCCCCTTGTCCCAGGCCCAGAGCTGCTCACAGCTGTGGCAGAGCCATTGCAGTTTCTAAGAACCTTCCGGGCTTTACTAGATGACGTGGTTTCTAGACATAATCATGTGTAGAGTTGATGTTTGTACACAATAAGTGATCATCGATGTCCTAACAGCATTTTATAGTAGGAGAGATTTACAAGTCTTTCTCAAATTAAGAAATTATGTACCAGGTCTATGCATATGTTTTTATTGCATAGAATAAAAACTCTAATTTTCCAAAC

Sekwencja nr 1: GAGTACCCACGCGGGTTTCG

Sekwencja nr 2: TGTATTCCGAAGTGTTTTTCCAGCTTGGGTAAT

Sekwencja nr 3: TGTCATTGGGATTGGGCACA

Do sekwencji nr 1 pasuje starter 2 jest to sekwencja zgodna czyli będzie to starter R

Do sekwencji nr 2 pasuje starter 1 i jest on komplementarny co daje nam starter F

Wnioski:

PCR jest metodą wymagającą dużej dokładności i precyzji nie tylko w wykonywaniu czynności manualnych i obliczeniowych ale również w zapewnianiu odpowiedniego środowiska reakcji, dobraniu odpowiednich starterów i temperatur poszczególnych etapów reakcji.

Nie udało się nam otrzymać powielonego DNA, co mogło być spowodowane różnymi czynnikami. Najprawdopodobniej próbka została zanieczyszczona, a ponieważ PCR jest bardzo czułą metodą miało to decydujący wpływ na wynik doświadczenia. Drugą przyczyną mogło być niedokładne wymieszanie po wprowadzeniu kolejnych substancji do próbówki.