Wykorzystanie

łańcuchowej reakcji

polimerazy (PCR) w

bezpieczeństwie

żywności

Wykład 16

WSTĘP

(1)

:

Tradycyjne (

klasyczne

) metody analizy

żywności -

pod kątem zawartości

bakterii patogennych

- opierają się na:

•

wstępnej hodowli namnażającej

•

przesianiu na podłoże stałe

•

identyfikacji poszukiwanych kolonii w
oparciu o przyjęte standardy diagnostyczne
często niezbędny jest również kolejny etap
identyfikacji

•

testy biochemiczne lub serologiczne

WSTĘP

(2)

:

!!! Metody tzw. klasyczne, choć uznawane za

niezawodne i skuteczne, wymagają

zazwyczaj kilku dni (czasami tygodni) do

momentu uzyskania ostatecznego rezultatu

Inne problemy związane z zastosowaniem metod

klasycznych:

•

fenotypowe cechy drobnoustrojów stanowiące
cechy identyfikacji nie ulegają ekspresji - co
uniemożliwia prawidłową diagnozę

•

tzw. formy vbnc

(viable but nonculturable)

- czyli

żywe lecz nie dające się hodować

(np.

Compylobacter i Vibrio, które posiadają duże znaczenie
epidemiologiczne ze względu na zachowane zdolności
infekcyjne)

WSTĘP

(3)

:

!!! Powyższe problemy związane z

klasycznymi metodami analizy żywności

pod względem zawartości bakterii

patogennych można rozwiązać za pomocą

metody łańcuchowej reakcji polimerazy

(PCR)

Wprowadzenie metody PCR do praktyki

diagnostycznej:

•

nie jest jak dotąd zbyt powszechne, mimo że
od czasu jej odkrycia upłynęło ponad 20 lat

•

wprowadzenie metody wymaga pewnych
wstępnych inwestycji instrumentalnych,
odczynnikowych i lokalowych

WSTĘP

(4)

:

•

wymaga odpowiedniego wyszkolenia personelu

•

wymaga oficjalnie przyjętych standardowych
regulacji i instrukcji

(warunek trudny do

spełnienia)

=====================================================================

====================

Wprowadzenie do praktyki metod PCR

wymagałoby od laboratorium:

•

znalezienie w literaturze szczegółowych metod
oznaczania danego mikroorganizmu

•

pełną walidację proponowanej metody

•

potwierdzenia, że metoda spełnia wszelkie kryteria
decydujące o możliwości użycia jej zamiast tradycyjnej,
bez uszczerbku dla wartości diagnostycznej

WSTĘP

(5)

:

•

Protokół walidacji alternatywnych metod
zawarty jest w dokumencie PN-EN ISO 16140

•

Dodatkowe dane dotyczące szczegółowych
wymagań, które winny spełniać systemy PCR
przeznaczone do oznaczania patogenów w
żywności zawarte są w normie ISO/DIS 22174

===================================================================

======================

!!! Olbrzymią pomocą dla laboratoriów

pragnących wprowadzić system PCR do

oznaczania patogenów w żywności jest

podjęty przez państwa Unii Europejskiej

projekt o nazwie FOOD-PCR

Celem projektu FOOD-PCR jest

(A)

:

•

adaptacja metody PCR, stosowanej
dotychczas głównie w naukowych
pracowniach badawczych i przekształcenie
jej w rutynowe narzędzie diagnostyczne

•

opracowanie, walidację i standaryzację
opartych na PCR metod pięciu głównych
patogenów:

– Salmonella ssp.
– termofilny Campylobacter
– enterokrwotoczna Escherichia coli (EHEC)
– Listeria monocytogenes
– Yersinia enterocolitica

Celem projektu FOOD-PCR jest

(B)

:

•

pełne wyniki projektu zawierają zestawy
starterów (primerów) dla ww. bakterii

•

opis warunków reakcji i zwalidowane
protokoły dostępne są na odpowiednich
stronach internatowych

================================================================

=========================

ZASADA METODY PCR

ZASADA METODY PCR

(1)

(1)

:

:

!!! W zasadzie metody PCR wykorzystuje

się możliwość powielania materiału

genetycznego (DNA) w probówce, poza

żywym organizmem

ZASADA METODY PCR

ZASADA METODY PCR

(2)

(2)

:

:

Kontrolowana synteza DNA wymaga

Kontrolowana synteza DNA wymaga

spełnienia szeregu warunków:

spełnienia szeregu warunków:

1) w probówce reakcyjnej musi być obecna

choćby

niewielka ilość DNA

diagnozowanego

organizmu

2) badane DNA stanowi wzorzec - matrycę, na

której odbywa się

wielokrotna synteza

komplementarnej cząstki DNA

3) proces taki nie zachodzi spontanicznie, lecz

odbywa się pod wpływem specyficznego

enzymu - polimerazy DNA

(wyizolowanych

najczęściej z termofilnych bakterii, co zapewnia jej
stabilność w szerokim zakresie temperatur)

ZASADA METODY PCR

ZASADA METODY PCR

(3)

(3)

:

:

4) w mieszaninie reakcyjnej

(oprócz wyżej

wymienionych)

muszą również znajdować się

w odpowiednim stężeniu

cztery podstawowe

nukleotydy

stanowiące materiał budulcowy

dla nowo powstającej nici DNA

5) do rozpoczęcia procesu powielania DNA

przez polimerazę, wymagana jest obecność

specyficznych kompleksów matrycowego
DNA z tzw

. starterami, czyli krótkimi np. 20-

nukleotydowymi odcinkami DNA

(startery

decydują, jaki specyficzny dla danej bakterii
gen lub jej fragment ma być powielany)

ZASADA METODY PCR

ZASADA METODY PCR

(4)

(4)

:

:

6) do prawidłowego przebiegu procesu

amplifikacji jednego fragmentu DNA
potrzebna jest

para starterów

komplementarny:

– jeden - do początku powielanego fragmentu DNA
– drugi - do końca powielanego fragmentu DNA
– każdy z nich do przeciwległej nici dwuniciowej

cząstki DNA

7) przyłączenie starterów do DNA następuje

dopiero po jego

termicznej, odwracalnej

denaturacji

- czyli po rozdzieleniu podwójnej

nici na pojedyncze

ZASADA METODY PCR

ZASADA METODY PCR

(5)

(5)

:

:

Etapy procesu PCR:

Etapy procesu PCR:

I.

Denaturacja DNA, przebiega w

urządzeniu o nazwie termocykler

II.

W termocyklerze dzięki powtarzającym

się kilkudziesiąciosekundowym impulsom
temperaturowym (np. 95

o

- 60

o

- 72

o

)

następuje kolejno:

•

DENATURACJA

•

PRZYŁĄCZENIE STARTERÓW

•

WYDŁUŻANIE STARTERÓW

(

czyli synteza

czyli synteza

nowego DNA

nowego DNA)

ZASADA METODY PCR

ZASADA METODY PCR

(6)

(6)

:

:

III.

Zazwyczaj przeprowadza się ok. 30

takich cykli, a w ich wyniku otrzymuje się
produkt - fragment DNA

•

pierwotna liczba kopii obecna w mieszaninie
zostaje teoretycznie powielona 2

30

razy

•

praktycznie, z uwagi na uwarunkowania liczba
ta jest mniejsza, nie mniej powstały produkt jest
łatwy do wykrycia

IV.

Sposoby wykrywania produktu

powielania (amplifikacji) np.:

•

przeprowadzenie krótkiej elektroforezy na żelu
agarozowym w obecności fluoryzującego
barwnika - bromku etydyny

ZASADA METODY PCR

ZASADA METODY PCR

(7)

(7)

:

:

V.

Obecność na żelu fragmentu DNA o

oczekiwanej wielkości jest dowodem, że w
probówce reakcyjnej obecny był DNA
poszukiwanego patogenu

Badaniom tego typu, obok badanej próbki o

nieznanej zawartości poszukiwanego patogenu,

powinna towarzyszyć:

•

kontrola negatywna (odczynnikowa)

•

kontrola negatywna, zawierająca oprócz
odczynników, DNA innego mikroorganizmu

(nie docelowego)

•

kontrola pozytywna, o której wiemy, że
zawiera DNA patogenu w odpowiedniej ilości

ZASADA METODY PCR

ZASADA METODY PCR

(8)

(8)

:

:

•

niekiedy, jako kontrolę pozytywną stosuje
się tzw. kontrolę wewnętrzną, a więc
dodaną do mieszaniny reakcyjnej razem z
próbką badaną:

– tym przypadku DNA dodane jako kontrola

wewnętrzna musi być tak spreparowane, aby
powstały produkt był innej wielkości niż
produkt uzyskiwany w wyniku obecności
DNA wykrywanego patogenu

– tego typu kontrole wewnętrzne

przygotowywane są z ramach projektu
FOOD-PCR

Granice wykrywalności PCR

(1)

:

!!! Metodę PCR cechują wielorakie

możliwości, ale jest to metoda mająca

również swoje ograniczenia praktyczne

•

Międzynarodowe standardy oparte na
tradycyjnych metodach detekcji wymagają,
aby istniała możliwość oznaczenia jednej
bakterii w 25 czy w 10 g żywności

•

Proces PCR przebiega najczęściej w
mieszaninie reakcyjnej o objętości 25-50
mikrolitrów, gdzie objętość dodanej próbki
badanego preparatu nie przekracza 5-10
mikrolitrów

Granice wykrywalności

PCR

(2)

:

•

???

Powstaje pytanie o liczbę bakterii, czy

też ich odpowiedników w postaci czystego
DNA, który musi się znaleźć w probówce
reakcyjnej dla uzyskania pozytywnego
wyniku

!!! Z dużą ostrożnością należy podchodzić

do wygłaszanych czasem opinii, że

wystarcza jedna komórka bakteryjna

•

Czułość taką osiągają (rzadko) niektórzy
badacze przy zastosowaniu złożonych
wieloetapowych systemów takich jak:
„nested” PCR lub RT-PCR

Granice wykrywalności

PCR

(3)

:

•

Przy jednoetapowym PCR rzadko kiedy
mniej niż 100 kopii badanego DNA daje
pozytywny rezultat, który jest
uzależniony od:

- jakości preparatu DNA
- rodzaju badanego genu
- liczby jego powtórzeń w komórce
- parametrów reakcji
- stosowanej aparatury

Granice wykrywalności

PCR

(4)

:

•

Pierwsze przybliżenie granic wykrywalności
może być określone w danych warunkach
laboratoryjnych za pomocą serii rozcieńczeń
preparatu DNA o znanym stężeniu
(

uzyskanego z mikroorganizmu będącego

przedmiotem naszego zainteresowania

)

•

Posiadanie takich wyjściowych danych
pozwala określić, jaki stopień namnażania
wykrywanego mikroorganizmu jest
niezbędny na wstępnym etapie
przygotowywania próbki do analizy tj.
hodowli na podłożu płynnym

Granice wykrywalności

PCR

(5)

:

•

Należy pamiętać, że w raz z oczekiwanym
patogenem namnażać się będzie mikroflora
towarzysząca, obecna w analizowanej próbce
żywności wprowadzonej do podłożą:

• zjawisko to działa hamująco na rozwój właściwego

patogenu

• zmianie ulegają granice oznaczalności preparatu, który

zawiera wielokrotnie więcej DNA „obcego” niż DNA
poszukiwanego

•

Innym czynnikiem, który należy brać pod uwagę
przy przygotowywaniu prób jest hamujący
wpływ różnego rodzaju inhibitorów zawartych
zarówno w podłożu jak i w badanej żywności:

• odpowiednia metoda odseparowania mikroorganizmów od

składników podłoża i właściwa metoda ekstrakcji DNA
rozwiązuje ten problem

Porównanie klasycznej metody wykrywania

Salmonelli z wykrywaniem opartym na PCR

______________________________________________________________________

•

25 g próbki lub wymaz

•

wstępne namnożenie w 225 ml wody peptonowej

______________________________________________________________________

Metoda konwencjonalna

PCR - czas

trwania ~ 24 h

- czas trwania 4- 5 dni
=========================================

==========

Selektywna pożywka namnażająca

Wirowanie, ekstrakcja DNA-

1h

Agar selektywny i diagnostyczny

Amplifikacja - 2 h

Identyfikacja biochemiczna

Wykrywanie produktu - 2 h

Serologiczne badanie potwierdzające

Sprzęt stosowany w metodzie

PCR

(1)

:

•

Warunki techniczne, które powinien spełniać
termocykler służący do rutynowych oznaczeń
są często surowsze niż w przypadku cyklerów
używanych do badań naukowych

•

Ocenia się, że około 90% tego rodzaju
urządzeń znajdujących się na rynku nie
nadaje się do tego typu pracy

•

Parametry urządzeń deklarowane przez
producentów powinny być zweryfikowane i
potwierdzone w odniesieniu do nowego
sprzętu, a także kontrolowane okresowo w
czasie eksploatacji

Sprzęt stosowany w metodzie

PCR

(2)

:

•

Zbadać należy rozłożenie temperatury w bloku
grzewczym i wykazać, że różnice w
poszczególnych gniazdach bloku nie
przekraczają 0,5

o

C; w tych samych granicach

powinna pozostawać temperatura bloku w
stosunku do temperatury zadanej

•

Kontroli wymaga szybkość z jaką termocykler
osiąga zadaną temperaturę (

termocykler podczas

przeprowadzenia amplifikacji wielokrotnie obniża lub
podwyższa temperaturę bloku przechodząc cykle grzania lub
chłodzenia, należy zwrócić uwagę na nachylenie tych
zmian

) - tempo przyrostu lub spadku

temperatury powinno być w urządzeniu dobrej
klasy niższe niż 4-5

o

C/sekundę

Sprzęt stosowany w metodzie

PCR

(3)

:

•

System gradientowy jest opcją wyposażenia
termocyklera niekonieczną, chociaż przydatną
- daje możliwość optymalizacji warunków
reakcyjnych

================================================================
=====================

Uwagi dotyczące polimeraz i

starterów

(1)

:

•

Termooporne polimerazy DNA produkowane
są zarówno przez firmy polskie jaki i
zagraniczne (dostarczają one również inne
odczynniki stosowane w biologii molekularnej)

Uwagi dotyczące polimeraz i

starterów

(2)

:

•

Polimerazy

(enzymy) odznaczają się różnymi

właściwościami:

– w zależności od szczepu bakteryjnego, z jakiego

zostały wyizolowane

– w zależności od dodatkowych obróbek jakimi były

poddane na poziomie genetycznym lub później

•

Powyższe właściwości decydują o
przeznaczeniu poszczególnych typów polimeraz

•

W ramach programu FOOD-PCR przebadano
najczęściej używane w PCR typy enzymów z
punku widzenia ich tolerancji na inhibitory
reakcji

Uwagi dotyczące polimeraz i

starterów

(3)

:

•

Startery

są istotnym elementem reakcji PCR:

•

Są to oligonukleotydy o długości 16-25
nukleotydów zaprojektowane w taki sposób,
aby ich sekwencja pasowała do odpowiedniej
sekwencji w wybranym fragmencie
genomowego DNA badanego organizmu

•

Para starterów flankuje specyficzny dla danej
bakterii fragment DNA - zazwyczaj nie krótszy
niż 100 nukleotydów i nie dłuższy niż 1000:

– zapewnia to przyzwoitą wydajność reakcji
– umożliwia łatwą identyfikacje produktu na żelu

Uwagi dotyczące polimeraz i

starterów

(4)

:

•

Sekwencje starterów uzyskane z literatury
lub z danych projektu FOOD-PCR zapisane w
postaci ciągu zasad nukleotydowych
wchodzących w ich skład (

np. 5’-

CGATAATTGGCGGCGCGTG-3’

) stanowią podstawę

do syntezy zamówionego związku przez
wybraną firmę, w której złożono zamówienie
[Koszt jednego startera wystarczający na
1000 oznaczeń wynosi ok. 50-100 zł]
[Czas oczekiwania na zamówiony produkt
waha się od kilku dni do 2 tygodni]

Uwagi końcowe

(1)

:

•

W ostatnim dziesięcioleciu nastąpiła
ogromna popularyzacja metod PCR (głównie
w naukowych instytutach badawczych)

•

Rozwojowi metod PCR sprzyja miedzy innymi
doskonalenie sprzętu (istotne narzędzie w
pracy biologa/ analityka/ lekarza)

•

Rosnąca liczba publikacji dotyczących
wykorzystania PCR w analizie żywności
wskazuje, że metoda ta będzie/ jest
stosowana do rutynowych oznaczeń
laboratoryjnych urzędowej kontroli żywności

Uwagi końcowe

(2)

:

•

Z chwilą zakończenia standaryzacji
prowadzonej w ramach projektu FOOD-
PCR metoda ta zostanie w pełni uznana
jako kolejny instrument stosowany obok
konwencjonalnych metod wykrywania
patogenów

•

Jej wprowadzanie rozpocznie się w
laboratoriach referencyjnych, a w
perspektywie czasowej około 10 lat
stanie się regularnym wyposażeniem
pracowni diagnostycznych