łańcuchowa reakcja polimerazy

- podstawowa technika biologii

molekularnej, która umożliwia

powielenie określonego fragmentu

DNA

P

C

R

(ang.

P

olymerase

C

hain

R

eaction)

Zakład Genetyki UW

Składniki reakcji PCR

• Matryca
• Polimeraza DNA

- syntetyzuje nić DNA tylko w jednym kierunku (5’→3’)

- do rozpoczęcia syntezy potrzebuje startera

• Startery
• Mieszanina dezoksyrybonukleotydów

(dNTP)

• Bufor

Zakład Genetyki UW

Zakład Genetyki UW

Kary Mullis –

wymyślając

w

połowie lat 80-tych technikę PCR
(łańcuchowej reakcji polimerazy),
zrewolucjonizował biologię
molekularną.

Zakład Genetyki UW

Startery to krótkie odcinki DNA komplementarne
do powielanej sekwencji

Zakład Genetyki UW

Zmiany temperatury podczas reakcji PCR

Przyłączanie

Przyłączanie starterów –
temperatura zależy od ich
długości i sekwencji

Wydłużanie

Wydłużanie – polimeraza
dobudowuje
komplementarną
sekwencję

Denaturacja

Denaturacja – nici DNA
rozłączają się pod wpływem
temperatury

Zakład Genetyki UW

Zalety:

• bardzo wysoka czułość
• specyficzność
• krótki czas trwania
• prostota

Zalety i wady PCR

Wady:

• bardzo wysoka czułość

Dlatego konieczne są odpowiednie

kontrole

czystości reakcji i jej prawidłowego

przebiegu. Jakie??

Zakład Genetyki UW

Kontrole reakcji PCR

Kontrola pozytywna (+):

• próba, o której wiemy, że w danych warunkach

reakcji da odpowiedni produkt

Kontrola negatywna (-):

• próba, w której przy zachowaniu właściwej

czystości pracy nie powstanie żaden produkt

Zakład Genetyki UW

Bufor,
nukleotydy,
startery,
polimeraza,
woda

We wszystkich
probówkach jest taka
sama mieszanina do
PCR, różnią się tylko
DNA

A

B

+

-

kontrole:

Potencjalny

wynik

reakcji:

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-

+

-

+

+

+

-

Kontrole reakcji PCR

Zakład Genetyki UW

Zadanie praktyczne

• Izolacja DNA z komórek nabłonka jamy ustnej

• Amplifikacja fragmentu mitochondrialnego DNA za

pomocą PCR

• Kontrola reakcji PCR – rozdział produktów reakcji w żelu
agarozowym (za tydzień)

Zakład Genetyki UW

Izolacja DNA

1. Wacikiem patyczka pocierać nabłonek jamy ustnej

(policzek) przez około 3 minuty.

2. Umieścić patyczek w 1,5 ml probówce w której

znajduje się 200 µl jałowej wody.

3. Przyciąć patyczek tak, aby można było szczelnie

zamknąć probówkę.

4. Umieścić probówkę na 5 minut w heat block (95 ºC).
5. Przenieść probówki do lodu i usunąć wacik starannie

go wyciskając o ściankę probówki.

ROZTWÓR, KTÓRY POZOSTAŁ W PROBÓWCE

ZAWIERA DNA, KTÓRY POSŁUŻY JAKO MATRYCA

W REAKCJI PCR

Zakład Genetyki UW

Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej

Do

0,5 ml

probówki odpipetować następujące objętości roztworów:

Zakład Genetyki UW

Nazwa

roztworu/odczynnika

Objętość (µl)

PCR MIX (zawiera bufor,
MgCl

2

, nukleotydy i startery)

37

Matryca

2

Polimeraza Taq (1u/µl)

1

Zakład Genetyki UW

Jaki fragment DNA amplifikujemy?

Substytucje nukleotydowe w ludzkim DNA mitochondrialnym

Region hiperzmienny

II

Region hiperzmienny

I

ND1

ND2

COX1

COX2

ATP8

ATP6

COX3

ND3

ND4L

ND4

ND5

ND6

CYTB

Region hiperzmienny II

Region hiperzmienny I

12S rRNA

16S rRNA

tRNA

Genom mitochondrialny człowieka

16569 pz

Region hiperzmienny II

Region hiperzmienny I

Region hiperzmienny II

Starter Lewy

Starter Prawy

Region hiperzmienny

II

Starter
Lewy

Starter Prawy

mtDNA:

Zakład Genetyki UW

Pętla D, jest kluczowym rejonem regulacyjnym w
mtDNA.

mtDNA charakteryzuje się zwartą
strukturą.

GATCACAGGT CTATCACCCT ATTAACCACT CACGGGAGCT CTCCATGCAT
TTGGTATTTT CGTCTGGGGG GTGTGCACGC GATAGCATTG CGAGACGCTG
GAGCCGGAGC ACCCTATGTC GCAGTATCTG TCTTTGATTC CTGCCTCATC
CTATTATTTA TCGCACCTAC GTTCAATATT ACAGGCGAAC ATACTTACTA
AAGTGTGTTA ATTAATTAAT GCTTGTAGGA CATAATAATA ACAATTGAAT
GTCTGCACAG CCGCTTTCCA CACAGACATC ATAACAAAAA ATTTCCACCA
AACCCCCCCC CTCCCCCCGC TTCTGGCCAC AGCACTTAAA CACATCTCTG
CCAAACCCCA AAAACAAAGA ACCCTAACAC CAGCCTAACC AGATTTCAAA
TTTTATCTTT TGGCGGTATG CACTTTTAAC AGTCACCCCC CAACTAACAC
ATTATTTTCC CCTCCCACTC CCATACTACT AATCTCATCA ATACAACCCC
CGCCCATCCT ACCCAGCACA CACACACCGC TGCTAACCCC ATACCCCGAA
CCAACCAAAC CCCAAAGACA CCCCCCACAG TTTATGTAGC TTACCTCCTC
AAAGCAATAC ACTGAAAATG TTTAGACGGG CTCACATCAC CCCATAAACA
AATAGGTTTG GTCCTAGCCT TTCTATTAGC TCTTAGTAAG ATTACACATG

Jaka jest sekwencja starterów?

Zakład Genetyki UW

Poniżej przedstawiono sekwencję 700 nukleotydów mitochondrialnego DNA

człowieka. Napisz sekwencję starterów o długości 20 nukleotydów, które

umożliwią namnożenie DNA, które odpowiada pogrubionej sekwencji.

Sekwencję starterów wpisz zgodnie z regułą 5’→3’. Jaką długość będzie miał

produkt reakcji PCR?

Zakład Genetyki UW

Starter lewy: TGATTCCTGCCTCATCCTAT

Starter prawy: GTGACTGTTAAAAGTGCATA

Długość produktu reakcji PCR: 302 pz

GATCACAGGT CTATCACCCT ATTAACCACT CACGGGAGCT CTCCATGCAT
TTGGTATTTT CGTCTGGGGG GTGTGCACGC GATAGCATTG CGAGACGCTG
GAGCCGGAGC ACCCTATGTC GCAGTATCTG TCTT

TGATTC

CTGCCTCATC

CTAT

TATTTA TCGCACCTAC GTTCAATATT ACAGGCGAAC ATACTTACTA

AAGTGTGTTA ATTAATTAAT GCTTGTAGGA CATAATAATA ACAATTGAAT
GTCTGCACAG CCGCTTTCCA CACAGACATC ATAACAAAAA ATTTCCACCA
AACCCCCCCC CTCCCCCCGC TTCTGGCCAC AGCACTTAAA CACATCTCTG
CCAAACCCCA AAAACAAAGA ACCCTAACAC CAGCCTAACC AGATTTCAAA
TTTTATCTTT TGGCGG

TATG

CACTTTTAAC

AGTCAC

CCCC CAACTAACAC

ATTATTTTCC CCTCCCACTC CCATACTACT AATCTCATCA ATACAACCCC
CGCCCATCCT ACCCAGCACA CACACACCGC TGCTAACCCC ATACCCCGAA
CCAACCAAAC CCCAAAGACA CCCCCCACAG TTTATGTAGC TTACCTCCTC
AAAGCAATAC ACTGAAAATG TTTAGACGGG CTCACATCAC CCCATAAACA
AATAGGTTTG GTCCTAGCCT TTCTATTAGC TCTTAGTAAG ATTACACATG

KLONOWANIE

1. trawienie restryktaza
wyizolowanego DNA,
trawienie wektora.

2. ligacja wektora ze
wstawką

3. transformacja bakterii

-

chemokompetentne

-

elektrokompetentne

4. selekcja (dzięki obecności
na wektorze genów
markerowych)

5. Wyszukanie
pojedyńczego klonu
zawierającego
zrekombinowany plazmid z
interesującym nas
fragmentem DNA

jeżeli uzyskamy dostateczna liczbę klonów, na tyle dużą, żeby
zawarte w nich wstawki reprezentowały cały genom, klony te
stanowią

BANK GENOMOWEGO DNA

ENZYMY RESTRYKCYJNE

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. W bakteriach pełnią funkcje obrony przed
wirusami

2. Enzymy restrykcyjne klasy II tną dwuniciowe
DNA w obrębie lub pobliżu określonej sekwencji !!

3. Rozpoznawane sekwencje są palindromowe,
zwykle 4 lub 6 nukleotydowe

Po cięciu enzymem
restrykcyjnym powstaja
fragmenty DNA z "lepkimi" lub
"tępymi końcami.

SmaI

CCCGGG

GGGCCC

CCC

GGG

GGG

CCC

CCCGGG

GGGCCC

XmaI

C CCGGG

GGGCC C

GGATCC

CCTAGG

G GATCC

CCTAG G

N GATCN

NCTAG N

NGATCN

NCTAGN

Sau3A

BamH1

IZOSCHIZOMER
Y:

RÓŻNE ENZYMY MOGĄ ZOSTAWIAĆ TAKIE SAME KOŃCE:

EcoRI jako

homodimer

LIGAZA "SKLEJA" DNA

Ligazy łączą dwa fragmenty DNA
poprzez utworzenie wiązań
fosfodiestrowych między grupą 3'
OH deoksyrybozy, a grupą
fosforanową

po ligacji plazmidu ze wstawką
powstaja 3 rodzaje cząsteczek !!!

WEKTORY- PODSTAWOWE

NARZĘDZIE W TECHNICE

KLONOWANIA

1. Najczęściej stosowanymi wektorami są plazmidy

2. Plazmidowe wektory bakteryjne powstały na bazie
plazmidów naturalnie występujących w komórkach bakterii.

3. Dostępne wektory plazmidowe zawierają pewne podstawowe elementy:

ORI- miejsce inicjacji replikacji. Specyficzne dla gatunku bakterii, od
specyfiki tego miejsca zależy liczba kopii plazmidu w komórce, plazmid
może zawierać kilka ori specyficznych dla różnych organizmów.
POLILINKER- sztucznie wytworzony odcinek DNA zawierający
sekwencje rozpoznawane przez wiele enzymów restrykcyjnych.
MARKER I- pozwala odróżnić bakterie posiadające plazmid, od tych
które go nie pobrały
MARKER II- pozwala odróżnić bakterie które pobrały plazmid ze
wstawką, od tych które pobrały "pusty" plazmid

DZIĘKI OBECNOŚCI DRUGIEGO MARKERA

WYKRYWAMY BAKTERIE NIOSĄCE

ZREKOMBINOWANY PLAZMID

W przypadku pBR322, bakterie niosące
zrekombinowany wektor nie będą rosły na
podłożu z tetracykliną

W przypadku pUC19 do odróżnienia
bakterii ze zrekombinowanym
wektorem wykorzystujemy zjawisko α-
komplementacji

Transformacja bakterii chemokompetentnych: