Biotechnologia - rozwiązywanie problemów technologicznych, zdrowotnych, ekologicznych za pomocą metod

Wykorzystanie biotechnologii

• Rolnictwo

• Zootechnika

• Ekologia i ochrona środowiska

• Przetwórstwo żywności

• Medycyna

• Biokopalnictwo

• Przemysł kosmetyczny

Biotechnologia wykorzystuje istniejące i zmodyfikowane genetycznie - GMO organizmy:

Bakterie

Drożdże

Pleśnie

Rośliny i zwierzęta oraz enzymy z nich pozyskane

Korzyści z biotechnologii

ekonomiczne - tańsza produkcja szczególnie żywności, biopaliw i innych przydatnych produktów

medyczne - organizmy o własnościach leczniczych, zwiększonej wartości odżywczej, produkujące leki

biologiczne - tworzenie przydatnych biologicznie organizmów, utrzymanie wymierających gatunków

Zastrzeżenia co do żywności GMO

1.Genetyczne - przeniesienie genów na inne organizmy szczególnie genu antybiotyko-oporności

2.Ekologiczne - Rozpełźnięcie się zmienionych organizmów po świecie

3. Zdrowotne

Alergiczne

Żywieniowe

Rakotwórcze

4. Etyczne - działanie przeciw naturze, tworzenie Frankensteinów - Frankenfood

Zagrożenia modyfikacjami genetycznymi

-Toksykologiczne i medyczne Powstanie w GMO związków toksycznych dla innych organizmów

-ekologiczne Zmiany w systemach ekologicznych - wypieranie przez GMO rodzimych gatunków

-biologiczne Niekontrolowane przeniesienie na inne gatunki i rodzaje „nowych” genów

Zagrożenia

Interakcje z ludzka mikroflorą

Modyfikacja endogennych komponent i spożytych ksenobiotyków

Zmiany kwasów żółciowych

Zwiększenie toksyczności ksenobiotyków

 

Produkcja niezidentyfikowanych składników

Eozynofilia- Myalgia Syndrom

Tryptofan był produkowany przez Bacillus amyloliquefaciens

W 1988 wprowadzono nowy szczep o zwiekszonej zdolności produkcji tryptofanu

Zanotowano 1500 EMS przypadków , 27 zgonów

Czystość tryptofanu była 99.6% pozostałe 0,4% to inne składniki w których był 1,1-ethylidenbis(tryptofan) - struktura b. podobna do tryptofanu która wbudowywała się w jego miejsce.

Największe zagrożenie manipulacjami genetycznymi to GMO mikroorganizmy

-Łatwość przekazywania materiału genetycznego pomiędzy rodzajami i gatunkami

-Bardzo szybkie rozmnażanie (co 20 - 30 min)

-Łatwe ukrycie manipulacji genetycznych

-Możliwość wydostania się GMO mikroorganizmów do środowiska

-Bardzo trudne do przewidzenia skutki ekologiczne, biologiczne, medyczne i ekonomiczne

Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (z angielskiego Polymerase Chain Reaction), technika umożliwiająca amplifikację (namnażanie) fragmentów DNA in vitro przy użyciu polimerazy DNA, umożliwiając wyprodukowanie milionów kopii fragmentu DNA w zaledwie kilka godzin.
Do przeprowadzenia PCR potrzebne są:
1) substrat - matryca DNA (fragment DNA do skopiowania: wystarczy pojedyncza cząsteczka, może to być również fragment DNA nie oddzielony od genomu);
2) krótkie, jednoniciowe fragmenty DNA - oligonukleotydy, umożliwiające rozpoczęcie procesu replikacji (tzw. startery);
3) pozostałe substraty tej reakcji - nukleozydotrifosforany (ATP, GTP, CTP, TTP);
4) enzym katalizujący tę reakcję - polimeraza DNA.
PCR zachodzi w trzech etapach:
1) denaturacja - rozdzielenie nici DNA (temperatura 95°C);
2) renaturacja - hybrydyzacja komplementarnych oligonukleotydów z rozplecionymi nićmi DNA (temperatura 54°C);
3) replikacja DNA - polimeraza DNA, przyłączając ATP, GTP, CTP, TTP, buduje komplementarne nici DNA (temperatura 72°C).
Podwyższenie temperatury powoduje rozpoczęcie ponownej reakcji PCR. Każdorazowo zostaje podwojona liczba kopii DNA. Obecnie w reakcji PCR wykorzystuje się odporną na denaturację w wysokich temperaturach polimerazę DNA, wyizolowaną z termofilnych bakterii Thermus aquaticus - nazwaną Taq.

Bioreaktory - Są to urządzenia skonstruowane w sposób umożliwiający kontrolę procesu produkcyjnego jego optymalny przebieg (pomiar i regulację parametrów) w warunkach maksymalnego ograniczenia lub całkowitego wyeliminowania możliwości zakażeń.

Pozwalają na prowadzenie procesów mikrobiologicznych, enzymatycznych oraz hodowli komórek organizmów wyższych.
Do podstawowych wymogów stawianych bioreaktorom przeznaczonym do procesów tlenowych należy duża sprawność w zakresie wymiany masy (tlenu) oraz odprowadzania wydzielającego się ciepła.
Do pracy w warunkach laboratoryjnych stosuje się bioreaktory o mniejszych pojemnościach. Zwykle od kilku ml do kilkunastu litrów. Są one wykonane całkowicie lub częściowo ze szkła i mogą być łącznie z podłożem i wyposażeniem uzupełniającym sterylizowane w autoklawach.
Zależnie od przeznaczenia, zasady działania i rozwiązań konstrukcyjnych można wyróżnić różne typy bioreaktorów:
Sposób prowadzenia procesu:
- bioreaktory do procesów okresowych
- bioreaktory do procesów ciągłych
- bioreaktory z zawracaniem lub zatrzymaniem biofazy
Rodzaj biokatalizatora:
- bioreaktory do klasycznych procesów mikrobiologicznych
- bioreaktory do hodowli komórek organizmów wyższych w zawiesinie
- bioreaktory do hodowli komórek organizmów wyższych na nośniku
- bioreaktory do procesów enzymatycznych w roztworze
- bioreaktory do procesów z użyciem biokatalizatorów unieruchomionych
Warunki hodowli drobnoustrojów, komórek:
- bioreaktory do hodowli na powierzchni podłoża
- bioreaktory z nośnikiem stałym
- bioreaktory do hodowli wgłębnej

• Inżynieria genetyczna

To celowa ingerencja w organizm, która polega na wprowadzeniu do genomu żywego organizmu nowych informacji genetycznych, czyli przenoszeniu genów z jednego organizmu do innego, bądź na zmodyfikowaniu genomu poprzez izolowanie lub eliminację genów.

Jest to pojęcie ogólne, do którego można zaliczyć m.in.:

klonowanie zwierząt,

namnażanie materiału genetycznego,

genetyczne modyfikacje roślin,

terapię genową,

modyfikację bakterii, np. w celu produkcji

ludzkiej insuliny lub antybiotyków.

Zakres manipulacji genetycznych

Wyróżniamy trzy rodzaje metod modyfikacji genetycznych, pozwalających uzyskać pożądane cechy.

1.Zmieniona zostaje aktywność genów naturalnie występujących w danym organizmie.

Metoda ta została wykorzystana w produkcji pomidorów Flavr Savr, które jako pierwsze GMO zostały w 1994 roku dopuszczone do obrotu w USA. Zmniejszono w nich aktywność genu, który odpowiada za proces dojrzewania
i mięknięcia pomidora. Otrzymano odmianę zmienioną genetycznie, choć w komórkach rośliny nie pojawił się żaden nowy element, żaden obcy gen.

2, Do organizmu wprowadzone zostają dodatkowe kopie jego własnych genów.

Powielenie genu - powoduje "namnażanie" pożądanej cechy (barwa, zawartość cukru).

Dotychczas nie wprowadzono do obrotu takich produktów.

3,Wprowadzony gen pochodzi
z organizmu innego gatunku.

Włączenie materiału genetycznego (DNA) do genomu innych organizmów roślin lub zwierząt, niezależnie od gatunku. Najbardziej powszechne zastosowanie tego rodzaju modyfikacji to przeniesienie genu z bakterii glebowej Bacillus thuringensis do roślin uprawnych. Dzięki temu wytwarzają one toksynę chroniącą je przed owadami. Tak zmodyfikowane rośliny zostały wprowadzone do obrotu.

Inżynieria genetyczna

Dotychczas najszersze zastosowanie inżynieria genetyczna osiągnęła na polu produkcji żywności.

Metody otrzymywania GMO

-Zwierzęta transgeniczne uzyskuje się także bezwektorowymi metodami. Transgen jest wprowadzony przez mikroiniekcję do zapłodnionego jaja lub komórki z wczesnego etapu rozwoju embrionalnego. Zmienione zarodki wszczepia się do macicy matki zastępczej, gdzie rozwija się genetycznie zmodyfikowane potomstwo.

-Wektorem przenoszącym transgen do komórek zwierząt są retrowirusy (wirusy zawierające RNA), którymi infekuje się komórki we wczesnym stadium rozwoju embrionalnego.

-Inną metodą jest pobranie i hodowanie komórki z wczesnego stadium rozwoju zarodkowego - blastocysty. Są to komórki linii zarodkowej ES /embryonic stem/.

Mają one zdolność różnicowania się we wszystkie inne typy komórek. Można je zmienić genetycznie w laboratorium, wszczepić do blastocysty i implantować do macicy matki zastępczej.

-„Wycinanie" genów i przenoszenie ich do genomów "gospodarza".
„Nożycami" genetycznymi są enzymy restrykcyjne - restryktazy.

Mają one zdolność rozpoznawania charakterystycznych miejsc DNA /określonych sekwencji zasad/ i przecinania go w tych punktach, zostawiając tzw. "lepkie końce", do których mogą być przyłączane dodatkowe geny.

-Aby przenieść gen do organizmu biorcy, potrzebny jest środek transportu, tzw. wektor.

U roślin doskonałym wektorem okazał się plazmid Ti bakterii Agrobacterium tumefaciens,

wywołującej guzowatość u roślin z rodziny różowatych.

W laboratorium można usunąć z plazmidu gen wywołujący narośla i wprowadzić do niego nowy gen, który ma być przeniesiony do rośliny.

W ten sposób plazmid Ti jest wykorzystywany w celu przenoszenia dodatkowych genów do roślin. Zakażenie roślin dodatkowym genem to transfekcja

-metoda pokrycia małych kuleczek złota lub wolframu cząsteczkami DNA a następnie wstrzeliwanie ich do jąder komórek tkanki roślinnej z użyciem tzw. "armatki genowej" /gaz pod dużym ciśnieniem/.

Technikę tę nazwano biolistyką i stosuje się ją zwłaszcza przy wprowadzaniu nowych genów do roślin jednoliściennych /zboża/.

-bezwektorowe metody modyfikacji roślin:

Chemiczną metodą jest dodanie odpowiedniego czynnika, np. glikolu polietylenowego - PEG.

Fizyczną metodą mogą być krótkotrwałe, wysokonapięciowe impulsy elektryczne lub mikroiniekcja, czyli wprowadzenie genu za pomocą igły do komórek roślinnych.

• GMO - przykłady

Pierwszą zmodyfikowaną genetycznie rośliną był tytoń - 1984 rok.

W roku 1986 modyfikacji poddano pomidora.

Od tego czasu zmodyfikowana została już większość roślin mających znaczenie gospodarcze.

Celem modyfikacji organizmów jest:

-uodpornienie ich na działanie niekorzystnych warunków, np. mróz, suszę lub zasoloną glebę

-uodpornienie na choroby: wirusowe, bakteryjne, grzybice

-uodpornienie roślin na herbicydy, czyli środki chwastobójcze

-uodpornienie roślin na owady żerujące najczęściej na liściach, zarówno w stadium dorosłym- imago, jak i larwalnym

-opóźnienie dojrzewania co ułatwia przechowywanie i transport;

-szybszy przyrost masy ciała zwierząt;

-zwiększenie wydajności mlecznej;

-transgeniczne zwierzęta gospodarcze otrzymuje się z myślą o wykorzystaniu ich jako producentów zrekombinowanych białek o znaczeniu farmaceutycznym

-(np. czynnik krzepliwości krwi, erytropoetynę leczącą anemię, ß interferon zwalczający infekcje wirusowe i nowotwory oraz hormon wzrostu)

Żywność Modyfikowana Genetycznie

zwana też transgeniczną, to żywność wyprodukowana z organizmów przetworzonych przez naukowców drogą przenoszenia genów z jednego gatunku do drugiego.

Genetycznie Modyfikowana Żywność (Żywność GM) to żywność:

-zawierająca GMO,

-składająca się z GMO lub

-wytworzona z GMO

W pracach genetycznych prowadzonych w celu uzyskania żywności transgenicznej dominują trzy kierunki:

-Wzbogacenie żywności w składniki podnoszące jej wartość żywieniową

-Usuwanie substancji szkodliwych i niepożądanych

-Poprawa cech funkcjonalnych związanych z procesami przetwórczymi

Quorum sensing - oddziaływania międzykomórkowe aktualny stan wiedzy perspektywy

Oddziaływania międzykomórkowe

Bakteria Bakteria

Bakteria Eukariota

Rodzaje oddziaływań

-Antagonizm - bakteriocyny, antybiotyki

-Symbioza - mutualizm, komensalizm

Regulacja funkcji życiowych komórek:

-Pobudzenie szlaków metabolicznych obecnością substratu

-Zahamowanie funkcji metabolicznych obecnością produktu

Quorum sensing jest to regulacja aktywności funkcjonalnej bakterii poprzez związki sygnałowe wydzielanie przez populację bakteryjną

Quorum sensing jest to regulacja aktywności funkcjonalnej bakterii oraz eukariota

Populacja bakterii bakterie

Populacja bakterii osobniki eukariota

Osobniki eukariota bakterie

Quorum sensing QS oparty na systemie sygnałowym acylowanym homoseryno laktonie (AHL), (quormons).

-System dotyczy bakterii G (-) które produkują, wykrywają i odpowiadają na sygnał AHL,

-Komórki syntetyzują i wydzielają do środowiska AHL ,

-Sygnał AHL wydostaje się z komórki poprzez aktywny transport albo bierną dyfuzję,

-Gdy komórki rozmnażają się - koncentracja AHL w środowisku rośnie,

-Gdy koncentracja AHL osiągnie odpowiedni poziom AHL wiąże się z białkiem transkrypcyjnym Lux R. R-AHL kompleks wiąże się z genem promotorowym i inicjuje ekspresje genów,

-Występują także represor-like R proteins; związanie z takim białkiem AHL powoduje represję aktywności genów.

AHL był izolowany, co potwierdzono bardzo dokładnymi analizami chemicznym, z plwociny pacjentów zakażonych P.aeruginosa albo B.cepacia.

Ponadto związek ten był izolowany z płuc myszy zakażonych eksperymentalnie P.aeruginosa

Funkcje życiowe bakterii regulowane przez QS

-Tworzenie biofilmów

-Ruchliwość komórek

-Przejście w stan spowolnionego funkcjonowania (starwation)

-Uruchamiane kasety genów odpowiedzialnych za stan fizjologiczny komórek w warunkach stresowych

-Śmierć komórek

-Sporulacja

-Procesy genetyczne

-Morfologia komórek

-Aktywność enzymatyczna

-Wirulencja

Możliwości wykorzystania QS w biotechnologii

-Skrócenie fazy przygotowawczej

-Przyspieszenie ekspresji fenotypowej fazy zastoju

-Niszczenie drobnoustrojów poprzez indukcję fazy zamierania

-Regulacja procesu dojrzewania produktów fermentowanych

-Regulacja procesów fermentacyjnych w celu maksymalizacji pozyskiwania pożądanego produktu i minimalizacji produktów niepożądanych

Biofilmy tworzą drobnoustroje przytwierdzając się do powierzchni na styku dwóch faz
Biofilmy tworzone być mogą na, praktycznie, każdej wilgotnej powierzchni
Biofilmy tworzone są najszybciej w układach, gdzie jest stały dopływ składników odżywczych

Biofilmy to:
zróżnicowana zbiorowość drobnoustrojów, występująca zwykle na powierzchniach stałych, zazwyczaj wielogatunkowa, chroniąca formy ją tworzące i sprzyjająca ich namnażaniu
Mikroorganizmy posiadają, zwykle, osłonkę syntezowanych przez siebie zewnątrzkomórkowych polisacharydów

Biofilmy mogą tworzyć się:
na stałych nawilżonych powierzchniach ,na powierzchni tkanek żywych organizmów,na powierzchni styku: faza wodna - powietrze
Jednymi z bardziej typowych miejsc powstawania biofilmów są:
skały (rafy) i inne twarde powierzchnie (kamienie, kadłuby statków) w środowisku morskim i słodkowodnym.

Biofilmy towarzyszą żywym organizmom: roślinom, zwierzętom

Powierzchnie różnych tkanek ( zęby, nabłonek wyścielający jelita, itp.)

omywane ciągle - bogatą w składniki odżywcze wydzieliną -

szybko tworzą zróżnicowane kompleksy mikroorganizmów osłonięte warstwą polisacharydowych śluzów otoczkowych przez siebie wydzielanych.

Biofilm złożony z organizmów: auto- i heterotroficznych
* Glony (algi) czerpią energię z procesu fotosyntezy; źródłem C - CO2.
* Bakterie - głównie heterotrofy- czerpią energię z materii organicznej, której źródłem są glony lub materiał spłukiwany do jeziora z lądu.

Biofilm złożony z:cząsteczek mineralnych,różnych mikroorganizmów,
siateczki śluzu lub glikokaliksu (strzałki) , która wiąże mikroorganizmy i cząsteczki

Glony - większe, okrągłe formy zielone - brązowe

Bakterie - mniejsze ciemne komórki przytwierdzone do glonów.

Oba typy komórek tworzą zewnątrzkomórkową warstwę śluzu otaczającą komórki.

komórki + polisacharydowe śluzy = biofilm.

Korzystne działanie biofilmów:
* uzdatnianie środowiska
** punkty uzdatniania wody

** oczyszczalnie ścieków, wód zrzutowych poprzez eliminację patogenów i materii organicznej

Drobnoustroje bytujące w biofilmach

-Są bardziej oporne na działanie antybiotyków i dezynfektantów

-Są bardziej oporne na niekorzystne warunki środowiskowe

-Są trudno usuwalne mechanicznie z powierzchni na której występują

Niekorzystne działanie biofilmów - medyczne:
Zagrożenie dla zdrowia pacjentów z implantami, cewnikami, itp.
powód nawracających infekcji - tworzenie się mieszanych biofilmów na sztucznych powierzchniach tworzonych przez implant, cewnik, itp..,
Glikokaliks, którym osłonięta jest bakteria: chroni ją przed działaniem antybiotyków
jest powodem uporczywości infekcji nawet przy zmasowanej chemoterapii
bakterie w osłonce biofilmu może być 50 - 1000 razy bardziej oporna na stosowane chemoterapeutyki niż ta sama - wolno żyjąca
Mechanizm zwiększonej oporności nie jest znany

Niekorzystne działanie biofilmów - technologiczne

-Powstawanie biofilmów w przetwórniach żywności powoduje uporczywe zanieczyszczanie produktów bakteriami z biofilmu,

-Powstawanie biofilmów na powierzchniach metalowych jest powodem korozji mikrobiologicznej

Etapy powstawania biofilmu w środowisku wodnym:
* adsorbcja składników odżywczych
* wyszukanie i zbliżanie się komórki do zasiedlanej powierzchni (wici, pili)
* asocjacja- wstępna faza adhezji (faza odwracalna)
* adhezja ( przytwierdzanie) - trwały związek między komórką a powierzchnią
* kolonizacja - tworzenie mikrokolonii
* produkcja egzopolimerycznych związków stanowiących osłonę przed nieko-
rzystnymi czynnikami środowiska - tworzenie trójwymiarowego biofilmu
egzopolisacharydy
alginian - Pseudomonas
kwas cholowy - E.coli
osłabienie cechy hydrofobowej ściany na korzyść wytwarzanych biosurfaktantów Zdolność tworzenia biofilmu jest cechą kodowaną genetycznie swoistość genów
* przytwierdzanie się innych organizmów - tworzenie mikrośrodowisk

Mikrofotografia:
duża liczba komórek Staphylococcus epidermidis pokrytych glikokaliksem, przytwierdzonych
na powierzchni catetera

Komunikacja interkomórkowa
Pozytywna - np. jakościowe i ilościowe zróżnicowanie substratu
Letalna - bakteriocyny,
wyżeracze (E.coli i Micrococcus xanthus)
Podtrzymuje warunki fizyko-chemiczne sprzyjające rozwojowi biofilmu Wytwarzany egzopolisacharyd może być materiałem zapasowym i ochronnym
Nabywanie przechodnich składników genetycznych (Plazmidy Transpozony)
Drobnoustroje tworzące najczęściej biofilm
E.coli
Pseudomonas sp

Biofilm epilityczny =biofilm tworzony na powierzchni wód

Mikroorganizmy tworzące biofilm powierzchniowy
bakterie - algi - sinice -- grzyby
Rozmieszczenie mikroorganizmów w biofilmie zależy od:

* tolerancji na światło
* rodzaju powierzchni
* obecności POM i FPOM

Mikrobiologiczni mieszkańcy biofilmów tworzą wielokomórkowe zbiorowiska w których w zależności od miejsca występowania drobnoustroju w biofilmie odgrywają one różne funkcje.

Tworzenie biofilmów przez drożdżaki zależy od:

Szczepu (szczepy patogenne tworzą biofilmy łatwiej niż niepatogenne)

Struktury podłoża

Stabilności fazy płynnej ( gdy faza płynna jest ruchoma powstaje większy biofilm)

Składu pożywki

Powstawanie biofilmu
Pierwszy krok
spontaniczne tworzenie się warstwy związków organicznych (aminokwasy i inne substraty pokarmowe).
białe ślady = zdrapana warstwa osadów organicznych osadzonych na szkiełku ( osad o określonej grubości)

Drugi krok
selektywne przytwierdzanie się bakterii cylindrycznych do pierwotnej powłoki organicznej.
* Rodzaj (skład) powłoki organicznej
* warunki w jakich powstaje
decydują o:
* rodzaju bakterii je zasiedlających,
* szybkości z jaką tworzony jest biofilm
Pierwsze - zasiedlające bakterie mają ( zwykle)
-rzęski
-długie fimbrie

Ryzosfera to strefa w otoczeniu korzeni roslin - obejmująca wzajemne relacje między korzeniami, mikroflorą gleby i glebą jako taką.
Korzenie roślin i związany z nimi biofilm wpływac mogą na chemizm gleby (pH i przekształcanie azotu).nitrogen transformations.  
*fluoryzujące na czerwono nitki grzybni przerastającej rizosferę- spring wheat -
*fluoryzujące głównie na czerwono - bakterie (część ASM Biofilm Collection)
 

---